生物化学与分子生物学-ppt课件.ppt

1、Molecular Biologyw Biochemistry Seeks to Explain Life in Chemical Termsw 生物化学（生物化学（Biochemistry）是研究生）是研究生命本质的科学。应用化学的理论技术命本质的科学。应用化学的理论技术及物理学、免疫学等原理和方法来研及物理学、免疫学等原理和方法来研究究的的 的科学的科学。 分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。 分子生物学(molecular biology)是生物化学的重要组成部分。 生物化学的发展简史生物化学的发展简史v静态生物化学时期静态生物

2、化学时期（二十世纪二十年代之前）（二十世纪二十年代之前）对生物体各种组成成分进行分离、纯化、结构测定、合成及理化性质的研究v分子生物学时期分子生物学时期（二十世纪五十年代以后）（二十世纪五十年代以后） 分子生物学的崛起及蓬勃发展，主要特点是研究生物大分子的结构与功能。 v 动态生物化学时期动态生物化学时期（二十世纪前半叶）（二十世纪前半叶） 研究生物体内物质的变化即物质代谢途径及其动态平衡重要贡献: 对脂类、糖类和氨基酸的性质进行了较为系统的研究 发现了核酸 化学合成了简单多肽 酵母发酵过程中“可溶性催化剂”的发现，奠定了酶学基础重要成果 营养学：发现了人类必需氨基酸、必需脂肪酸和多种维生素

3、内分泌：发现了多种激素，并将其分离、合成 酶学：酶结晶获得成功 物质代谢：对生物体内主要物质的代谢途径已基本确定nDNA双螺旋结构的提出n重组DNA技术PCR、转基因(transgene)、基因剔除（gene knock out）等n核酶(ribozyme)的发现n人类基因组计划(human genome project)n后基因组研究（蛋白质组学proteomics） 1985年5月，加州大学校长Robert提出测定人类基因组全序列 1986年3月，诺贝尔奖获得者Dulbecco首次提出人类基因组计划的概念 1990年10月，正式启动人类基因组计划 1999年7月，中国科学院遗传研究所承担了

4、1%的测序工作 2000年6月，全部基因的测序工作完成 2001年2月，人类基因组图谱完成我国生物化学的发展 公元前已有运用生物化学知识和技术的先例 吴宪创立了血滤液和血糖测定法 1965年首先合成了具有生物活性的胰岛素 1981年成功合成了酵母丙氨酰tRNA 近年来，在基因工程、蛋白质工程、人类基因组计划以及新基因的克隆和功能研究取得了重要成果生物化学研究的主要内容生物分子的结构与功能生物分子的结构与功能核酸、蛋白质分子的结构及其与功能间的关系物质代谢及其调节物质代谢及其调节代谢途径及其调节的分子机制基因信息传递及其调控基因信息传递及其调控基因信息传递过程的机制及基因表达时空调控的规律信号转

5、导与基因工程信号转导与基因工程二十一世纪是现代生物科学的世纪 生物科学是当代自然科学中发展最迅速、对人类的生存和自身发展影响最大的学科领域之一。统计美国“科学引文索引（SCI）”收录的4500余种学术刊物，发现有2350种左右为生物科学相关杂志！统计全世界引用指数（Impact factor）在10以上的超一流学术刊物，也发现80%左右（97年48种刊物中有38种）是生物科学相关刊物。 学 科 杂志总数 10平均引用指数 30杂志数 总 论 317.80化 学 211.80物理522.02数学118.20生物3819.17 下面让我们来看一看从1910年到现在分子生物学史上的一些情况。 191

6、0年，德国科学家Kossel获得了诺贝尔生理医学奖，他首先分离出腺嘌呤、 胸腺嘧啶、和组氨酸。 1959年，Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功地合成了核糖核酸，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。而Kornberg则实现了DNA分子在细菌细胞和试管内的复制。他们共同分享了当年的诺贝尔生理医 学奖。 1962年，Watson和Crick因为在1953年提出了DNA的反向平行双螺旋模型而与Wilkins共享诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X射线衍射研究证实了Watson和Crick 的DNA模型。 1965年，Jacob和Monod由于提出并证实了操

7、纵子作为调节细菌代谢的分子机制而获得了诺贝尔生理医学奖。同时他们还预言了mRNA分子的的存在。 1969年Nirenberg由于在破译DNA遗传密码方面的贡献，与Holly和Khorana等人分享了诺贝尔生理医学奖。Holly的主要功绩在于阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸 序列，并证实所有tRNA具有结构上的相似性，而Khorana第一个合成了核酸分子， 并且人工复制了酵母基因。 1975年，Temin和Baltimire由于发现在RNA肿瘤病毒中存在以RNA为模板，逆转录生成DNA的逆转录酶而共享诺贝尔生理医学奖。 1980年，Sanger因设计出一种测定DNA分子内核苷酸序列的方法而获得了

8、诺贝尔生理医学奖。DNA序列分析法至今仍被广泛应用，是分子生物学最重要的研究手段之 一。 1984年，Kohler、Milstein和Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。 1988年，McClintock由于在20世纪50年代提出并发展了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。 1989年，Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。Bishop和Varmus由于发现正常的细胞同样带有原癌基因而分享当年的诺贝尔生理医学奖。 1993年，Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理

9、医学奖。 Mullis由于发明PCR仪而与第一个设计基因定点突变的Smith共享诺贝尔化学奖。 1994年，Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。 1995年，Lewis、Nusslei-Volhard和Wieschaus由于在20世纪4070年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而分享诺贝尔生理医学奖。 生物化学与医学的关系：密切相关、相互促进临床医学的发展也要经常运用生物化学的理论和方法诊断、治疗和预防疾病，而且许多疾病的发生机理也需要从分子水平上加以探讨。 生物化学 生理学药理学免疫学遗传学病理学生物化学对现在及未来医学的影响对疾病机

10、理的认识深入到分子水平改变现有的医生看病模式诊断技术的更新治疗方法的突破给未来的器官移植带来福音流行病防治将有大改观基因保健品和基因化妆品将被广泛应用药物基因组学将成为药物开发的主战场延长人类寿命第二章 蛋白质的结构与功能Structure and Function of Protein蛋白质在生命过程中具有重要作用蛋白质在生命过程中具有重要作用 几乎一切生命现象都要通过蛋白质的而体现出来 了解蛋白质的结构和功能，是探求生命奥秘过程中最基本的任务本章要点本章要点 蛋白质的组成：元素、基本单位蛋白质的组成：元素、基本单位 蛋白质的结构：结构层次蛋白质的结构：结构层次 蛋白质结构与功能的关系蛋白质

11、结构与功能的关系 蛋白质的理化性质及分离纯化蛋白质的理化性质及分离纯化第一节、蛋白质的分子组成第一节、蛋白质的分子组成 组成蛋白质的基本元素组成蛋白质的基本元素 碳：5055% 氢：6%7% 氧：19%24% 硫：04% 有的还含磷，少数含铁、铜、锌、锰、钴、钼等 由样品中的氮元素含量推算蛋白质含量： 每克样品中含氮克数6.25100=100克样品中蛋白质含量(克%) 100克样品中蛋白质含量(克%) *16%=每克样品中含氮克数*100一、组成蛋白质的基本单位氨基酸 （amino acid）（一）氨基酸的结构通式： 1. 非极性氨基酸非极性氨基酸：7种，包括5种脂肪族氨基酸、苯丙氨酸、一般脯

12、氨酸也列入此类。它们的R基团具有疏水性疏水性，不易溶于水。一般说来其侧链越大，疏水作用也越强。（二）（二） 氨基酸的分类氨基酸的分类 2. 极性氨基酸极性氨基酸：8种，包括3种含羟基氨基酸（酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸）、色氨酸和蛋氨酸、2种酰胺氨基酸、和半胱氨酸。它们的R基团有极性，但不解离，或仅极弱地解离，有亲水性亲水性。半胱氨酸和酪氨酸的侧链极性最强。 3.碱性氨基酸碱性氨基酸：共3种，有精氨酸、赖氨酸精氨酸、赖氨酸和组氨酸和组氨酸。R基团有极性，且解离，在中性溶液中显碱性，亲水性强。 4.酸性氨基酸酸性氨基酸：共2种，有天冬氨酸和谷氨酸天冬氨酸和谷氨酸。R基团有极性，且解离，在中性溶液中显酸

13、性，亲水性强。 稀有氨基酸(常见氨基酸的衍生物） OH HC CH2 H2N CH2 CH CH2 CH2 CH COOH HC CH2 COOH OH NH2 NH 4-羟基脯氨酸 5-羟赖氨酸非蛋白质氨基酸 如：D-谷氨酸、D-苯丙氨酸等（三）氨基酸的理化性质：在某一 pH的溶液中，氨基酸解离成阳阳离子离子和阴离子阴离子的趋势及程度相等趋势及程度相等，成为，呈电中性电中性，此时溶液的溶液的pH称为该氨基酸的等电点。 n两性解离及等电点(isoelectric point) 等电点计算公式：pI=1/2（pk1+ pk2） Pk1和 pk2分别为-羧基和-氨基的解离常数的负对数 多个解离基团

14、的等电点计算： pI=1/2（pkR+ pk2）v其他性质其他性质v紫外吸收 色氨酸、酪氨酸含有苯环共轭双键，在紫外光区最大吸收峰*茚三酮反应 常用于氨基酸的定性、定量分析二、肽 肽肽(peptide)：一分子氨基酸的氨基氨基和另一分子氨基酸的羧基羧基脱水缩合生成的 肽键肽键(peptide bond)：一分子氨基酸的氨基氨基和另一分子氨基酸的羧基羧基脱水缩合生成的 肽键平面图1-7、肽键平面v二肽、三肽寡肽(oligopeptide)（10），多肽(polypeptide)v氨基酸残基(residue)、氨基末端(amino terminal ) （N末端）、羧基末端(carboxyl te

15、rminal)（C末端）v蛋白质和多肽在分子量上很难划出明确界限常见的生物活性肽 谷胱甘肽（glutathione,GSH）：机体内重要的还原剂 多肽类激素 催产素（9肽）、加压素（9肽） 、促肾上腺皮质激素（39肽） 、促甲状腺释放激素（3肽） 神经肽(neuropeptide)：在神经传导过程中起信号转导作用 脑啡肽（5肽） 、内啡肽（31肽） 、强啡肽（17肽）等三、蛋白质的分类蛋白质类别举例非蛋白成分（辅基）单纯蛋白质血清蛋白，球蛋白无核蛋白病毒核蛋白，染色体蛋白核酸糖蛋白免疫球蛋白、粘蛋白，蛋白多糖糖类脂蛋白乳糜微粒、低密度脂蛋白、极度密度脂蛋白、高密度脂蛋白各种脂类磷蛋白酪蛋白、卵

16、黄磷酸蛋白磷酸色素蛋白血红蛋白、黄素蛋白色素金属蛋白铁蛋白、铜兰蛋白金属离子结合蛋白质结合蛋白质=蛋白质+辅基 根据形状分类：球状蛋白质：分子接近球形，如血红蛋白、肌 红蛋白 纤维状蛋白质：分子类似纤维，如胶原蛋白、弹性蛋白第二节 蛋白质的分子结构一级结构二级结构三级结构四级结构空间结构(conformation)一、蛋白质的一级结构(primary structure) 定义：蛋白质分子中。Human Insulin Amino Acid Sequence MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVEL

17、GGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN 二、蛋白质的二级结构(secondary structure) 是肽链中各主链原子在各局部空间的排列分布状况，不涉及R侧链的空间排布。 主要靠H-键维系结构定义：蛋白质分子中某一段肽链的。（一）肽单元与肽键平面 肽单元肽单元(peptide unit)：参与肽键的6个原子 C1，C，O，N，H，C2位于同一平面上， C1、C2在平面上所处的位置为反式，此同一平面上的6个原子构成了一个肽单元，这个平面叫做肽键平面。 肽键平面是构成主链构象的肽键平面是构成主链构象的基本单位基本单位。 以肽键平面为基本单位的旋转就

18、是肽链折叠、盘旋的基础。（二）二级结构中的主要构象形式稳定二级结构的主要作用力为氢键1、 -螺旋(-helix) 多肽链的主链围绕中心轴上升，呈有规律的右手螺旋。 要点： C 原子的旋转3.6氨基酸/圈、螺距为5.4A，1.5 A/氨基酸残基，100 /氨基酸残基。 -螺旋是一种常见的较为稳定、也较为致密的二级结构。 H-键稳定螺旋,-螺旋形成时遇到脯氨酸会被中断2、 -折叠(-pleated sheet) 肽键平面间折叠成锯齿状的结构称为-折叠结构，两段以上平行排列，称为-折叠层或-片层。 要点：折叠角度110度，H键稳定结构，只含5-8个氨基酸残基，片层有顺向平行和反向平行。 片层结构是肽

19、链较为延展和松弛的结构 许多蛋白质既有-螺旋又有-片层结构。3、其他构象形式1） -转角(- turn)（ -回折、发夹结构） 要点：180度回折，3-6残基（一般为4个残基），有较大的自由度，转角第二个残基常为脯氨酸，常有甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、色氨酸。2） 无规卷曲(random coil) 无确定规律性的 卷曲方式。（三）模序(motif)与结构域(domain) 模序（motif） 又叫模体、基序、基元。 是蛋白质分子空间结构中某些立体形状或拓扑结构颇为类似的，常有特殊特殊的结合功能的结合功能，其序列长度一般也比结构域短短。如与DNA结合调控基因表达的几种结构单元。 有些模序仅由几

20、个氨基酸残基组成，如：纤连蛋白中与受体结合的肽段，只有RGD三肽。C.锌指结构A.钙结合蛋白 （EF手型结构） B.亮氨酸拉链 蛋白质的二级结构是以一级结构为基础的。相同电荷会妨碍-螺旋的形成。 蛋白质空间构象的真确形成，需要分子伴侣(chapeton)的参与，使肽链正确折叠。 结构域 是蛋白质分子中较长的相似序列在立体结构中形成或半独立的部分，可具有一定的功能可具有一定的功能。n结构域与模序是相对独立的一种蛋白质空间结构，其层次位于超二级结构和三级结构之间。在有些书中，结构域与模序的概念并未做严格的区分。三、蛋白质的三级结构（tertiary structure) 定义：蛋白质分子中，整条多

21、肽链中全部氨基全部氨基酸残基酸残基相对空间位置，包括所有原子所有原子在三维空间的排布。 即全部二级结构的总和及所有侧链原子的空间排布和它们的相互作用关系，包括主链构象和侧链构象的全部内容。 维系三级结构的共价键是二硫键，非共价键主要是H-键、盐键、疏水键和范德华力。肌红蛋白的三级结构 肌红蛋白是由153个氨基酸残基组成的单个肽链的蛋白质，含有一个血红素辅基 有A至H8个螺旋区，两个螺旋区之间有一段无规则卷曲，脯氨酸位于转角处 由于R基团的相互作用，形成一个球形分子，亲水侧链位于球表面，疏水侧链位于球内部四、蛋白质四级结构(quaternary structure) 定义：两条和两条以上具有独立

22、三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成的蛋白质空间结构。 不是所有的蛋白质都有四级结构，只有不止一条多肽链的蛋白质才有四级结构。 胰岛素的两条多肽链通过共价键相连，也不具有四级结构。 构成四级结构的每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基或亚单位（subunit）。 亚基聚合成四级结构的作用力主要是盐键和H-键，也有疏水作用和范德华氏力。 构成四级结构的亚基可以相同也可以不同。 亚基间的聚合较疏松，聚合与解聚互为可逆，这也是调节蛋白质功能活性的一种方式。 某些蛋白质分子可以进一步聚合成聚合体，其中的重复单位称为单体，通过次级键相连（聚合），所以，聚合与解聚是可逆的，单体与聚合体的互变与蛋白质的功

23、能有关。 单体与亚基的不同：单体是均一的而亚基可以有所不同（如催化亚基、调节亚基等）；单体可以游离存在而一般亚基不会单独存在。血红蛋白 胰岛素二级结构二级结构结构域结构域三级结构三级结构四级结构四级结构第三节 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质分子的一级结构是形成空间结构的基础，而蛋白质的生物功能又是由蛋白质分子特定的天然空间构象所决定的。因此研究蛋白质结构与功能的关系，是从分子水平上认识生命现象的一项重要任务。 一、蛋白质一级结构与功能的关系（一） 蛋白质一级结构是其高级结构形成的基础和决定性的因素。蛋白质的多肽链一旦在生物体内被合成后，即可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。

24、 （二）一级结构相似的蛋白质空间构象 及功能也相似v一级结构与进化 在各种细胞色素C中几乎只有28个位置上的氨基酸残基是完全不变的。 不同种属的细胞色素C的氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关，亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多。细胞色素C中氨基酸变异情况与生物进化的分类基本平行，故可据此描绘出。 猕猴和人类的细胞色素C一级结构只有一个氨基酸的差异。 猩猩和人类的细胞色素C一级结构完全相同。 面包酵母与人类的细胞色素C一级结构相差51个氨基酸。 各种生物亲缘关系差别较大，但具有相同功能的蛋白质，其一级结构中与功能密切相关的氨基酸顺序不会发生变化（三）一级结构中关键氨基酸残基的改变会影响蛋白

25、质的功能 参与功能活性部位功能活性部位的残基或特定构象关键部位的残基具有重要的作用，即使整个分子中只发生一个残基的异常，该蛋白质的功能也会受到明显的影响。 分子病：蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序发生变异所导致的遗传病。v镰刀状红细胞性贫血血红蛋白遗传信息的异常 正常DNATGT GGG CTT CTT TTTmRNAACA CCC GAA GAA AAAHbA(亚基)N端苏-脯-谷谷-谷-赖异常DNATGT GGG CAT CTT TTTmRNAACA CCC GUA GAA AAAHbs(亚基)N端苏-脯-缬缬-谷-赖二、蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质的。 构象发生变化，其功能活性也

26、随之改变，蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关。 蛋白质在一些因素的触发下，发生微妙的构象变化，从而调节其功能活性。 两个部位：功能部位功能部位和和调节部位调节部位以肌红蛋白（肌红蛋白（Mb)和和血红蛋白血红蛋白(Hb）为例，说明蛋白质空间结构和功能的关系。 肌红蛋白 血红蛋白 4个吡咯环由4个甲炔基连接成一个平平面面，血红素的铁原子共有6个配位键，其中4个与血红素的吡咯环的N结合，一个与肌红蛋白亚基F螺旋区的第8位组氨酸(F8)残基的咪唑基的N相连接，空着的一个配位键可与O2可逆地结合 （一）血红素的化学结构（二）血红蛋白和血红素辅基的结合血红蛋白亚基间及亚基内的盐键（三）

27、血红蛋白的构象变化与结合氧血红蛋白能可逆地与O2结合，氧合血红蛋白占总血红蛋白的百分数随O2浓度的变化而改变。血红蛋白的氧解离曲线为S曲线，肌红蛋白的氧解离曲线为直角双曲线Mb与Hb的氧解离曲线 协同作用协同作用：一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体另一亚基与配体的结合能力。正协同作用正协同作用负协同作用负协同作用 未结合氧时，血红蛋白的/和/呈对角排列，结构较为紧密，称为紧张态（T态） 氧与血红蛋白结合后，4个亚基羧基末端之间的盐键断裂，二、三、四级结构发生变化，使/和/的长轴形成15。的夹角，结构相对松弛，称为松弛态（R态）血红蛋白T态与R态的互变血红蛋白氧合与脱氧构象转换蛋白质的变构效

28、应 变构效应变构效应 变构效应亦称别构效应，是指一个蛋白质与它的配体结合后，蛋白质的构象发生变化,使它更适合于功能的需要，这一类变化称为变构效应。 变变( (别别) )构蛋白质构蛋白质( (酶酶) ) 是指具有别构效应的蛋白质或酶。 变构剂变构剂 亦称效应剂,是指凡能触发蛋白质或酶分子发生变构效应的物质，多为一些较小的有机分子。 蛋白质“折叠病” 蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变也能引起疾病，那就是所谓“构象病”，或称“折叠病”。 疯牛病，它是由一种称为Prion蛋白质的感染引起的，致病Prion与正常Prion的一级结构完全相同，只是空间结构不同。 由于蛋白质折叠

29、异常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常转运到位所引起的疾病还有老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内障等等。 由于分子伴侣在蛋白质折叠中至关重要的作用，分子伴侣本身的突变显然会引起蛋白质折叠异常而引起折叠病。 第四节、蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质是由氨基酸氨基酸组成的大分子化合物大分子化合物，所以既有氨基酸的一部分性质，如两性电离、等电点、呈色反应、成盐反应等，又有大分子的一般特性，如高分子量、胶体性等。 蛋白质的理化特性是由其组分及结构所决定的，通常情况下，蛋白质分子结构的改变会最终导致其某些理化特性的变化。（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质

30、的两性电离 由于蛋白质是由氨基酸分子聚合而成，游离的氨基酸残基侧链基团及两端的氨基和羧基都可能解离成带正电或负电的基团，因此，蛋白质分子可呈两性解离，是两性电解质。如天冬氨酸、谷氨酸残基侧链的羧基可解离而带负电，赖氨酸残基的侧链氨基、精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的咪唑基可解离而带正电。一、蛋白质的理化性质蛋白质分子中的各种可解离基团受介质pH的影响，蛋白质所带电荷也随之改变。 NH3+ NH3+ NH2| +OH- | +OH-|Pr-COOH = Pr-COO- = Pr-COO- +H+ +H+ 阳离子 兼性离子阴离子pHpI 蛋白质分子的两性解离特性是由其一级结构决定的，含酸性氨基酸多的

31、蛋白质，其水溶液为弱酸性；含碱性氨基酸多的蛋白质，其水溶液为弱碱性。因此，蛋白质分子在水溶液中的解离状态由所含氨基酸残基的R侧链的种类和数量所决定。而R基的解离又和溶液的pH值密切相关。(pI)： 在一定的介质中，某一蛋白质解离成阴、在一定的介质中，某一蛋白质解离成阴、阳离子的趋势相等，成为阳离子的趋势相等，成为两性离子两性离子(净电荷为净电荷为零零)，此时介质的，此时介质的pH称为蛋白质的等电点。称为蛋白质的等电点。 不同的蛋白质因所含酸性或碱性氨基酸的比例不同，等电点亦不相同。根据蛋白质等电点的不同可通过电泳进行分离蛋白质。 （二）蛋白质的胶体/ /高分子性质蛋白质是蛋白质是蛋白质的物理性

32、质符合胶体定义 球状蛋白质分子量在0.6100万之间 ；直径在胶体颗粒的范围(1100nm) ；球状蛋白质溶于水 分子中的亲水氨基酸残基多位于颗粒表面，在水溶液中能与水起水合作用。胶体的性质胶体的性质 丁达尔现象丁达尔现象 ；布朗运动；布朗运动 ；不能透过半透膜；不能透过半透膜 ；扩散速度慢；粘；扩散速度慢；粘度大度大 蛋白质在水溶液中稳定存在的原因1）水化层2）表面电荷 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固1、蛋白质的变性、蛋白质的变性 在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏空间结构被破坏，从而导致理化性质理化性质改变和生物学活性的丧失改变和生物学活性的丧失（如酶失去催化活力，

33、激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用。 一般认为蛋白质变性本质变性本质是次级键，二次级键，二硫键的破坏硫键的破坏，只有，并不涉及一级结构的变化。 引起变性的因素 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂、尿素、等。 物理因素：加热、射线、超声波、剧烈震荡等。 表现：变性后蛋白质溶解度降低，蛋白质的粘度增加，易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点则不一 定沉淀；变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化。 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链相互缠绕而聚集，因而从溶液中析出，这一现象称为蛋白质沉淀。 消除蛋白质在溶液中的稳定因素则会造成蛋白质的沉淀。常用的有中性

34、盐、有机溶剂、某些生物碱试剂、重分子酸类及重金属盐类。 a盐析 破坏蛋白质的水化膜。常用硫酸铵和硫酸钠。不同的蛋白质需要不同的盐浓度沉淀。蛋白质不变性。b有机溶剂 降低溶液的介电常数，破坏蛋白质的水化膜。但必须低温，否则蛋白质会变性。 c 其他 生物碱试剂，有机酸根，重金属盐能与蛋白质解离后的带电离子结合而沉淀。可用于尿蛋白的检测和重金属盐中毒的抢救。 变性蛋白的复性变性蛋白的复性 有些变性程度较轻的蛋白质经去除变性因素后，可恢复或部分恢复恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性复性。 这种变性称为可逆变性。 但许多蛋白质变性后并不能复性，称为不可逆变性。变性复性去除变性因素化学试剂变性2、

35、变性、沉淀和凝固的关系 变性蛋白质不一定沉淀变性蛋白质不一定沉淀 沉淀蛋白质不一定变性沉淀蛋白质不一定变性 沉淀蛋白质也不一定凝固沉淀蛋白质也不一定凝固 但凝固的蛋白质一定已变性，且为不可逆变性但凝固的蛋白质一定已变性，且为不可逆变性 接近等电点时加热使蛋白质变性可使蛋白质凝固。而远离等电点时不会凝固或沉淀。（四）蛋白质的紫外吸收有最大吸收峰。因其含有芳香族氨基酸残基-色氨酸、酪氨酸。可用于蛋白质含量的测定。 200-220纳米有最大吸收，是由肽键引起的（五）蛋白质的呈色反应 1. 茚三酮反应 蛋白质水解成氨基酸的显色反应 2. 双缩脲反应 肽键+硫酸铜 紫红色化合物 3. 酚试剂反应 蛋白质

36、+Cu2+ 蛋白-Cu复合物 蛋白-Cu复合物 兰色化合物稀碱溶液还原福林试剂 二、蛋白质分离纯化的一般策略二、蛋白质分离纯化的一般策略选择合适的原料粗分精制备 挑选富集的组织、细胞或细胞器。 一般采用匀浆、电动捣碎或超声波破碎法等。如破碎细菌，可采用超声波破碎、反复冻融及加入溶菌酶的方法。 除去大部分杂蛋白。 如有机溶剂沉淀或盐析，分级离心等。收集及浓缩所需的蛋白质部分。利用不同蛋白质性质的差异，采用离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶以及一些免疫的方法进一步纯化。三、蛋白质的分离与纯化（一）利用蛋白质的沉淀反应进行纯化（一）利用蛋白质的沉淀反应进行纯化v丙酮沉淀及盐析

37、 原理 丙酮沉淀：低温下去除蛋白质水化层 盐析：高浓度中性盐去除蛋白质水化层及表面电荷 结果：蛋白质不变性 血清中的白蛋白溶于pH7.0左右的半饱和的硫酸铵溶液中，但球蛋白在此溶液中沉淀。（二）利用蛋白质两性解离的性质进行分离 电泳1 2 3 4SDS-PAGE考马丝亮蓝染色 离子交换层析 离子交换层析是一 类常用的蛋白质分 离方法，利用蛋白 质的解离可以对其 进行离子交换层析 分离不同的蛋白质。（三）利用蛋白质的高分子性质进行分离纯化 透析 去除小分子物质和浓缩。 凝胶过滤 又叫分子筛。 超速离心可以分离蛋白质，也可以测定蛋白质的分子量。蛋白质在高达50万g的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直

38、至其浮力与离心力相等，沉淀停止。（四）一级结构的测定 1953年Sanger完成1.1.测定氨基酸的组分测定氨基酸的组分 分析蛋白质纯品中氨基酸残基的组成 蛋白质用6M盐酸在摄氏110度下真空水解18到36小时，用茚三酮显色、气相色谱或质谱确定氨基酸的种类和数目。 2.2.确定多肽链中氨基末端和羧基末端确定多肽链中氨基末端和羧基末端 DNFB或丹磺酰氯于氨基末端结合，色谱或荧光分析确定氨基末端的氨基酸。 肼解法或羧肽酶裂解出羧基末端的氨基酸，可确定羧基末端的氨基酸。3.3.大分子蛋白质裂解成小分子的肽段大分子蛋白质裂解成小分子的肽段 胰蛋白酶、糜蛋白酶或溴化氰可将蛋白质从特定位点水解，层析或电

39、泳分离纯化小分子肽段。4.4.肽段序列的测定肽段序列的测定 一般采用Edman降解法。利用苯异硫氰酸（PTC）与肽结合，衍生物在稀酸作用下肽末端的残基脱落成PTC-氨基酸衍生物，逐个脱落的氨基酸衍生物可得到鉴定，一般30-40个氨基酸。 5.5.各种肽段重叠排列对比，得出整个多肽链得顺序各种肽段重叠排列对比，得出整个多肽链得顺序 一般应用不同的蛋白酶或溴化氰进行裂解以得到不同裂解方式的肽段并进行测序。一级结构测定的意义 1.进一步研究蛋白质的高级结构及结构与功能间的关系 2.有助于对某些疾病病因的探讨 3.通过比较蛋白质的一级结构了解物种间进化的关系 3. 直接测序法：1. 氨基酸的组成测定2

40、. 确定多肽链中氨基末端和羧基末端 以作为整条多肽链的标志点。3. 将肽链水解成片段进行分析4. 肽段序列的测定5. 各种肽段重叠排列对比，得出整个多肽链的顺序 四、多肽链中氨基酸序列的分析 利用核酸顺序进行推导DNA序列 mRNA序列 氨基酸序列五、蛋白质空间结构测定 常用方法： X-射线晶体衍射法“蛋白质结构与功能蛋白质结构与功能” 名词名词：氨基酸的等电点肽单元及肽键平面蛋白质的一级结构蛋白质的亚基 变构效应与变构蛋白蛋白质的等电点蛋白质的变性知识点知识点蛋白质的基本组成单位 氨基酸的分类氨基酸的理化性质 蛋白质的分类蛋白质的结构层次及其含义一级结构与构象和功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系 血红蛋白与氧结合的变构效应蛋白质的变性和复性常用分离蛋白质的方法和原理（利用了蛋白质什么样的理化性质） 谢 谢