siRNA和RNAi(PPT课件).ppt

1、RNAi的发现简史RNAi的作用机制和特征siRNA的制备方法siRNA的设计原则RNAi的应用RNAi实验举例 RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA (dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。 1990年Rich Jorgensen设想，将更多的色素基因注入植物体，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，当时称共抑制（cosuppression)。 1994年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制 (quelli

2、ng)。 1995年Guo和Kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但没有增加该基因的表达，反而产生与反义RNA同样的结果特异性阻断该基因的表达，从而正式表明RNA 干扰现象的存在。 Cell.1995 May 19;81(4):611-20. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Gu

3、o S, Kemphues KJ.1998年Fire等发现将dsRNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和Kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。他们称此现象为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC.Nature. 1998 Feb

4、19;391(6669):806-11. mRNA 正义RNA 无抑制（污染）（反向互补）反义RNA 抑制微弱 双链RNA 抑制强烈 蛋白质 Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization pr

5、obe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell s

6、tage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) Negative control uninjectedantisense RNA injected dsRNA 1999年，Hamilton等首次在PTGS（转录后基因沉默）植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Za

7、more和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）引发RNAi。 2000年，Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。siRNAshRNA2006年诺贝尔

8、生理学或医学奖颁发给2位美国科学家：Andrew Z.Fire和Craig CMello，以表彰其在RNA干扰双链RNA引发的基因沉默领域所做出的杰出贡献。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。 第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶切割加工成2123

9、nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。 RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。Dicer contains two

10、 RNAseIII domains siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。 新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）。 u转录后水平的基因沉默。u高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。u高效性：相对少量的dsRNA就能完全抑制相应基因的表达。u可遗传性及远距离效应：

11、RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。udsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。uATP依赖性：可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。u位置效应：不同位置的双链RNA对基因沉默效率的不同。 化学合成体外制备 体外转录 “鸡尾酒”法（用Rnase消 化长片断双链RNA制备siRNA） 体内表达 siRNA表达载体表达载体 siRNA表达框架表达框架常规化学合成siRNA为19nt + 3overhangs（2nt）的双链RNA，未 经修饰，如图所示。 Sens

12、e：正义链，RNA，序列与靶序列相同； Antisense：反义链，RNA，序列与靶序列互补； dTdT：两端悬垂，DNA，均在3端； 形式：双链，已退火；优点：得到的siRNA纯度高并且无需进行任何其他实验，适用于已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量的siRNA进行研究。缺点：合成价格高昂，不适用于筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以

13、达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。优点：价格便宜，试剂盒使用方便。适用于筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。缺点：需要进行其他实验，且siRNA的合成量受到限制。不适用实验需要大量的，一个特定的siRNA进行长期研究。 例如： Ambion的SilencerTM siRNA Construction Kit其过程如下：首先针对靶基因的mRNA在体外转录合成长dsRNA；再用RNaseIII或Dicer对长dsRNA进行酶解，形成一组siRNAs的混合物；最后将该混合物导入细胞内。用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾

14、酒” 就可以避免上述两种方法的缺陷。 例如： Ambion的SilencerTM siRNA Cocktail Kit优点：可以避开烦琐的siRNA设计与筛选工作，快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。 缺点：有可能产生非特异性基因的抑制，而且在有效地抑制基因表达后并不知道真正起作用的siRNA。不适用于长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的

15、优点在于不需要直接操作RNA。针对siRNA进入细胞后容易被降解，并且进入细胞siRNA的数量不受控制的情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链序列克隆入载体内，位于RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。优点：使siRNA直接在体内得到表达，是用于RNAi长期研究的唯一方法。在载体上的抗性标记能帮助快速筛选出阳性克隆。适用于已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。 缺点：由于此方法涉及构建克隆，所以需要进行大量的实验，如构建克隆、序列测定等，可能需要几周甚至数月的时间。 第一种是设计

16、成可自然形成发夹的RNA（22nt），两种RNA聚合酶（Pol）启动子（U6或H1）控制一段反向重复序列（中间被可变间隔序列分开）转录，结果可在胞内合成具有发夹结构的双链RNA（含1929nt的茎和39nt的环），其中1929nt的茎与靶基因序列互补。另外，此发夹RNA的3末端含有4个或4个以下的尿嘧啶。 第二种是将两个U6启动子（一种RNA聚合酶启动子）串联在一起或置于两个分开的载体中以引导19nt的siRNA正义和反义链转录，正义、反义链在体内退火连接成双链siRNA。此siRNA中所含的19nt序列与靶基因互补，且siRNA的3末端亦含4个或4个以下的尿嘧啶。siRNA表达框架(siRN

17、A expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。SECs是筛选siRNA的最有效工具，如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。优点：与siRNA表达载体相比其优点是无需克隆可直接导入细胞，但在表达框的两端加上酶切接头后也可克隆入载体，方便客户使用。适用于筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。 缺点：PCR产物很难

18、转染到细胞中不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。 不适用于长期抑制研究。 比较项目比较项目化学合成化学合成体外转录体外转录RNaseRNase III III降降解解dsRNA质粒载体质粒载体腺病毒载腺病毒载体体逆转录病毒逆转录病毒载体载体PCRPCR表达框表达框材料需求 21-mer RNAoligos(一对)29-mer DNA oligos(一对)转录模版(200-1000bp，两侧带T7 启动子)55-60-mer DNA oligos(一对) 50-mer DNA oligos(一对)全部制备/合成时间所需时间4天2周24 小时 + DNA

19、oligo合成时间1 天 + 转录模版制备时间5天以上 + DNA oligo合成时间 6 小时+ DNA oligo合成时间 个人所需操作时间几乎不需要中等中等多多多中等是否需要验证和寻找最有效siRNA需要需要不需要需要需要需要需要能否标记siRNA 能能能不能不能不能不能转染的相对难易程度好好好中等好很好很差可筛选性 (例如抗生素筛选) 不可以不可以不可以可以可以可以不可以能否适用于长效抑制不适用不适用不适用不适用不适用适用不适用能否大规模制备可以有限有限可以可以可以有限检测总体转染效率不可以不可以不可以可以可以可以不可以每个基因的相对费用（不包含人力）很高中等低低高中等中等优点方便，几

20、乎无需研究人员工作。得到siRNAs的时间短。无需检测和筛选有效siRNA序列，较省钱。可以简单地大量制备导入效率高，可感染静止期的细胞RNAi效果可永久持续得到siRNAs的时间非常短。缺点费用高，定制周期长。实验规模受到限制。可能易引发非特异性沉默。RNAi效果持续时间短，导入效率低RNAi效果持续时间短，制备病毒较费时间不能感染静止期的细胞。很难转染。如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题。基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。1.从转录本（mRNA）的AUG起始密码

21、开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA重复)来设计。2.避免在起始密码子或终止密码子域附近选择目的序列。3.siRNA序列的GC含量应为30%-50%左右。4.在设计siRNA时不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域。5. 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性，例如使用BLAST。6.选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。7.负

22、对照:一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由pol启动子控制。2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点，便于克隆入载体。3.Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转

23、录的发生。5.shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。6.shRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5TCAAGAG3序列最为有效。7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。RNAi在探索基因功能中的应用RNAi在基因治疗领域

24、中的应用 病毒性疾病的治疗 遗传性疾病的治疗 肿瘤的治疗RNAi在整形外科领域的应用在植物学中的应用在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。病毒性疾病

25、的治疗：RNAi具有对抗侵入性遗传因子（如病毒、转座子、转基因）的作用、打破其复制循环、减弱或消除其基因毒性作用 。由于RNAi也存在于哺乳动物细胞中，RNAi或许可被利用来治疗病毒性疾病。 RNAi与人类免疫缺陷病毒RNAi与肝炎病毒RNAi与Rous肉瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA 既可以产生多个基因同时沉默。遗传性疾病的治疗：美国西

26、北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi与脆性X染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。 化学合成双链siRNA 设计合成单链DNA 转染 载体构建 效应检测 转染 mRNA水平和蛋白水平 筛选查找文献；查找靶基因mRNA； 利用网络在线支持，寻找siRNA序列； 根据目的选择实现RNAi的策略：载体法； 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo； 构建载体； 转染； 检测效应（包括干扰效应和

27、生物学效应）2、http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ ；3、http:/ or http:/；1、检索文献，获取有实验证明的有效的靶点序列，并核对；一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。 mRNA水平：RT-PCR、Real-time PCR；蛋白质水平：Western-blot、ELISA、免疫组化；细胞表型水平：MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。PBK在乳腺癌中的功能研究RT-PCRMTT实验克隆形成实验 RT-PCR 克隆形成实验 MTT实验 control si-#3 RNAi是近年来才发现的一种古老的、保守的生物途径，是生物体适应外界环境、调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的重要机制，具有重大的生物学意义。 RNA干扰被Science杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。 随着对RNAi机制研究的深入和RNAi技术的不断完善，RNAi有望成为治疗各种疾病的新方法。 THANK YOU！