现代分离技术-高效液相色谱(HPLC)课件.ppt

1、目目 录录一、高效液相色谱仪简介一、高效液相色谱仪简介 二、键合相色谱法二、键合相色谱法三、亲和色谱法三、亲和色谱法四、体积排阻色谱法四、体积排阻色谱法五、建立高效液相色谱分析方法的一般五、建立高效液相色谱分析方法的一般 步骤步骤第一节、高效液相色谱仪简介第一节、高效液相色谱仪简介一、经典液相柱色谱与高效液相色谱法的比较二、高效液相色谱法的特点（1）分离效能高：新型高效微粒固定相填料（2）选择性高：同分异构体、旋光异构体（3）检测灵敏度高：紫外10-9g，荧光10-12g（4）分析速度快：高压输液泵三、高效液相色谱仪的组成 其组成部件主要包括：储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录

2、仪、数据处理装置等。1、流动相及储液罐（1）流动相在使用前需经脱气处理（2）流动相放入储液罐前需经0.45m滤膜过滤（3）储液罐材料耐腐蚀、使用过程宜密闭（4）进行梯度洗脱时，流动相纯度要高、互溶性要好，同时应选择对溶剂组成不敏感的检测器2、色谱柱的使用和维护（1）避免较强机械振动，以免柱床产生空隙（2）避免压力、温度的急剧变化（3）应逐渐改变流动相组成（4）色谱柱不宜反冲（5）生物样品不宜直接进入柱内（6）常用强溶剂清洗色谱柱以清除杂质（7）保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇（8）色谱柱的再生A、反相柱再生：依次以MeOH：H2O（95：5）、MeOH、CH2Cl2洗脱，每种溶剂冲洗20-3

3、0倍柱体积，再以相反顺序冲洗色谱柱B、正相柱再生：依次以正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇洗脱，20-30倍柱体积，再以相反顺序冲洗，注意脱水C、离子交换柱再生：稀酸缓冲液冲洗使阳离子树脂再生；稀碱缓冲液冲洗使阴离子树脂再生3、检测器（1）紫外检测器：固定波长、全波长扫描（二极管阵列检测器，DAD）（2）示差折光检测器：通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度的检测器，为通用型检测器（可指示样品在流动相中的浓度）（3）电导检测器：用于检测阴离子或阳离子，在离子色谱中广泛应用（4）荧光检测器：利用某些溶质在受紫外光激发后，能发射可见光（荧光）的性质来进行检测。对不产生荧光的物质，可

4、与荧光试剂反应后测试。消除溶剂干扰和因温度变化引起的基线漂移、死体积小、灵敏度高通用型质量检测器，对各种物质均有响应，且响应因子基本一致，不依赖于样品分子中的官能团，且可用于梯度洗脱。（5）蒸发激光散射检测器（ELSD）第二节、键合相色谱法第二节、键合相色谱法一、分离原理1、正相键合相色谱法分离原理 极性键合固定相：将全多孔微粒硅胶载体经酸活化处理成表面含有大量硅羟基的载体后，再与含氨基、氰基、醚基的硅烷化试剂反应，声称表面具有氨基、氰基、醚基的极性固定相。溶质在此类固定相上的分离机理属于分配色谱。2、反相键合相色谱法分离原理非极性键合固定相：将全多孔微粒硅胶载体经酸活化处理后与含烷基链（C4

5、，C8，C18）或苯基的硅烷化试剂反应，声称表面具有烷基或苯基的非极性固定相。关于反相键合相的分离机理有两种论点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。二、化学键合相的类型及应用范围1、氨基柱：具有强极性，一级胺可与醛、酮的羰基反应生成Schiff碱，因此不能用氨基柱分析分离含羰基化合物，分离时使用的流动相中也不能含羰基（如丙酮）2、氰基柱：具有中等极性，对酸、碱性样品可获得对称的色谱峰，对含双键的异构体或双键环状化合物具有良好的分离能力。3、芳硝基柱：具有电荷转移功能，呈弱极性，对芳香族化合物及多环芳烃具有良好的分离选择性。三、使用键合固定相应注意的问题1、硅胶键合相的稳定性正相键合

6、相的稳定性要低于反相键合相反相烷基键合相的稳定性与流动相的pH值相关，通常水溶液的pH应保持在2-8之间，pH大于8.5会引起基体硅胶的溶解。2、键合相柱的再生正相键合相柱可用甲醇-氯仿（1：1）流动相进行再生，反相键合相柱可用甲醇再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基甲酰胺或约0.01M无机酸水溶液进行再生。四、流动相1、溶剂的选择性分组 常用溶剂可分为8个选择性不同的特征组，处于同一组中的溶剂具有相似的特性，因此对某种指定的分离，若某种溶剂不能给出良好的分离选择性，就可以用另一种其他组的溶剂来替代。2、选择流动相的一般原则3、改善色谱分离选择性的方法（1）调节流动相的极性（2）向流动相中加入

7、改性剂 a、离子抑制法：加入酸、碱、缓冲液抑制溶质离子化 b、离子强度调节法：向含水流动相中加入无机盐后，使流动相的表面张力增大，减弱残存硅羟基的干扰，可抑制峰形托尾并改善分离效果五、离子对色谱法 离子对色谱法是将一种或数种与样品离子电荷（A+）相反的离子（B-，称为对离子或反离子）加入到色谱系统的流动相（或固定相）中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，此离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中。第三节、亲和色谱法第三节、亲和色谱法一、分离原理：锁钥结构络合物的生成亲和色谱法的分类二、固定相 亲和色谱固定相由基体、间隔臂、配位体三部分构成。1、基体（1）葡聚糖凝胶：Sephadex G （2

8、）琼脂糖凝胶（3）聚丙烯酰胺及其衍生物性质如下表性质如下表（4）甲基丙烯酸酯共聚物 可耐受脲、盐酸胍、有机溶剂的处理，富含醇羟基和醚基，可用多种方法活化，如TSK Toyopearl HW-65F凝胶（5）高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物2、配位体（1）染料配位体 三嗪染料配位体：此类染料结构与酶的天然底物结构相似，故可与酶或蛋白质的活性位点结合。如人血清白蛋白的纯化（2）定位金属离子配位体 如（3）包合配合物配位体（4）生物特效配位体（5）共价配位体三、流动相1、非选择性洗脱法2、特殊洗脱法第四节、体积排阻色谱第四节、体积排阻色谱体积排阻色谱凝胶过滤色谱 GFC凝胶渗透色谱 GPC一、分离原

9、理一、分离原理1、分布系数KD2、溶质容量因子KD凝胶渗透极限：KD=1.0，凝胶固定相所有孔洞均能接受样品分子凝胶排阻极限：KD=0，凝胶固定相所有孔洞均不能使样品分子进入因此在SEC中，不同尺寸样品分子的分布系数总是保持在0-1之间。以所分离样品的分子量（以所分离样品的分子量（M）和组分从）和组分从柱中洗脱时的洗脱体积柱中洗脱时的洗脱体积VC绘制校正曲线绘制校正曲线3、SEC的分离特点的分离特点（1）、洗脱体积位于）、洗脱体积位于V0至至V0+VP之间，因此色谱柱的峰容量是有限之间，因此色谱柱的峰容量是有限的，一般只能容纳的，一般只能容纳10-12个色谱峰个色谱峰（2）、不能用于分子大小组

10、成相）、不能用于分子大小组成相似，或分子大小仅差似，或分子大小仅差10%的组分分的组分分析析二、固定相二、固定相1、固定相的分类（1）软质凝胶Sephadex，Sepharose，Bio-Gel A、P等系列，常用于中、低压色谱，不适用于高柱压。（2）半刚性凝胶Styragel，NGX系列，聚苯乙烯凝胶，适合有机溶剂做流动相，可承受至少10MPa的柱压（3）刚性凝胶多孔球形硅胶羟基化聚醚多孔微球如TSK系列2、凝胶固定相的特性参数（1）渗透极限凝胶可用来分离化合物分子量的最大值，超过此极限，高分子量化合物都从凝胶颗粒间的空隙处流出，而无分离效果。市售凝胶均由渗透极限大小确定产品规格。（2）分离

11、范围lgM-VC校正曲线的线性部分。实际使用中可串联两到三根不同规格的凝胶柱，以扩充其分离范围。三、流动相体积排阻色谱法中，样品的分离与样品、流动相之间的相互作用无关，因而无需采用改变流动相组成来改善分离度。选择流动相时应注意：1、凝胶渗透色谱的流动相续表2、凝胶过滤色谱的流动相使用以水为基体的具有不同pH值的缓冲溶液为流动相（1）常加入无机盐如氯化钠、氯化钾、氯化铵等以消除吸附作用及基体疏水作用（2）当需洗脱生物大分子蛋白质时，可加入离液序列试剂，如盐酸胍、聚乙二醇、脲、十二烷基磺酸钠等。四、凝胶的实验技术（附）1、凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶

12、体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-200的吸水量为20，1 克Sephadex G-200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快 2、凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法

13、在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。 3、样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白超过4，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30。 分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。 4、防止微生物的污染防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类交联葡聚糖和琼脂

14、糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有用的抑菌剂有: 叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20时约为40；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。 可乐酮Cl3C-C(OH)(CH3)2在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60时易引起分解而失效。 乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0

15、. 01。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。 苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。 五、Sephadex LH-20的使用（附） 适合用于有机溶剂分离亲脂性分子。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。 结合凝胶过滤、分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。 产品 LH-20分离范围（球蛋白） 100

16、-4000颗粒大小（m） 20-150特性/应用 胆固醇，脂肪酸，激素，维他命，天然产物 PH稳定性 213最高流速（cm/h） 400 凝胶过滤的上样量一般为5-7的床体积，我们建议初次上样量控制在1-2的床体积，视分离情况可以逐步增加 难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷 上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大。 反相系统： 以甲醇-水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。正相系

17、统： 以氯仿-甲醇最为常见，先用50氯仿-甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。 二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。 甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附 凝胶的装填 Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。 1、在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，参考胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。2、使溶胀的胶体积沉淀之后占总体积的75，上层溶剂占25，这时，悬浮液从一个容器倒入另一个容器时胶粒

18、可移动。 3、将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。 1、上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质2、为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。 3、样品体积应该占柱总体积的1-2，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。 4、洗脱流速应根据情况而定，最大线流速约12cm/min（反压1.5ba），建议流速为1-10cm/h。总体来说，较低的流速，具有较高的分辨率。 5、凝胶再生通常事先用2-3

19、个柱体积的洗脱液进行清洗，如果换洗脱液，则需要重新平衡。 凝胶操作条件：1、pH范围：2-112、化学稳定性：pH2以下及强氧化剂中不稳定3、121可耐受20分钟4、操作温度：4-40 5、可加入抑菌剂（如20乙醇，0.04叠氮钠），切勿冷冻 6、保存条件：4-25 ，干燥六、云芝多糖的分离及相对分子量测定（例）1、分离条件摸索 对于未知分子量的样品，通常是采用Line 柱进行粗分离, 摸索分子量大概范围及其分离条件，再以此条件选择系统的合适孔径柱子进行细分离。针对芸芝多糖是水溶性高分子混合物，因而选择水溶性Ul-trahydrogel - line 柱摸索分离条件。 2、选择色谱柱 由云芝多

20、糖在Ultrahydrogel-line 柱上的粗分离最佳条件以及根据凝胶柱的分子量分离范围, 我们选用Ultrahydrogel - 1000 + 2000 型双柱串联 3、流动相的离子强度影响 考察不同离子强度的流动相对云芝多糖在Ultrahydrogel - line 柱上的吸附影响情况 当盐浓度在50 mmol/ L NaNO3 时分离效果较好, 继续降低盐浓度, 峰面积虽然增大但分离效果变差。故最佳离子强度盐浓度为50 mmol/ L NaNO34、校正曲线制作 配制系列窄分布Pullulan 多糖标样, 其浓度与样品浓度一致, Mr 分别为12. 5 105 、8. 50 105

21、、5. 01 105 、1. 56 105 、6 104 、2. 85 104 。在相应的色谱条件下得到校正曲线，计算出 曲线拟合公式5、云芝多糖各组分相对分子质量测定 根据GPC 校正曲线及云芝多糖色谱流出峰，可计算云芝多糖各流出组分的数均相对分子质量和重均相对分子质量。第五节、建立高效液相色谱分析方法的一般步骤第五节、建立高效液相色谱分析方法的一般步骤一、样品的性质及柱分离模式的选择一、样品的性质及柱分离模式的选择1、样品的溶解度非极性化合物：吸附、正相分配、正相键合相色谱极性化合物：反相分配、反相键合相色谱水溶性样品：pH为中性：非离子型化合物，反相键合相色谱pH为弱酸性：流动相中加入硫

22、酸或磷酸，再用反相键合相色谱分析pH为弱碱性：流动相中加入阳离子型反离子，再用离子对色谱法进行分析pH为强酸、碱性：离子对色谱法2、样品的分子量范围脂溶性样品： 分子量2000且分子量差别不大非离子型：吸附或键合相色谱离子型：离子对色谱法分子量2000：聚苯乙烯凝胶的凝胶渗透色谱法水溶性样品： 分子量2000且分子量差别不大：吸附或分配色谱法 分子量2000且分子量差别很大：刚性凝胶的凝胶过滤色谱法 分子量2000：聚醚凝胶的凝胶过滤色谱法3、样品的分子结构和分析特性（1）同系物的分离（2）同分异构体的分离（3）对映异构体的分离（4）生物大分子的分离凝胶过滤色谱或亲和色谱法基于样品分子结构对分离系统的选择基于样品分子结构对分离系统的选择二、分离操作条件的选择二、分离操作条件的选择最满意的分离度最短的分离时间最低的流动相消耗最大的检测灵敏度