第十五章DNA重组技术的基本原理PPT课件.ppt
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1、第十五章第十五章 DNADNA重组技术重组技术的基本原理的基本原理第一节第一节 DNADNA重组的技术要件重组的技术要件DNA重组技术:重组技术:基因工程亦称遗传工程,即利用基因工程亦称遗传工程,即利用DNA重组技术方法,把重组技术方法,把DNA作为组件,在细胞外将一种外源作为组件,在细胞外将一种外源DNA(目的基目的基因)和载体因)和载体DNA重新组合连接(重组),最后将重组重新组合连接(重组),最后将重组体转入宿主细胞,使外源基因体转入宿主细胞,使外源基因DNA在宿主细胞中,随在宿主细胞中,随细胞的繁殖而增殖(细胞的繁殖而增殖(cloning克隆),或最后得到表达克隆),或最后得到表达,最
2、终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状,最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。基因工程的关键技术是基因工程的关键技术是DNA重组,但二者并不等同。重组,但二者并不等同。DNA重组重组的的 技术路线技术路线Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeSlection for cells coteining a recombi
3、nant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制备、目的基因的制备2、载体的构建、载体的构建3、目的基因与载体、目的基因与载体的重组的重组4、重组、重组 体导入宿主体导入宿主细胞进行扩增细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定、克隆基因的鉴定一、重要的工具酶及其作用特点一、重要的工具酶及其作用特点一般把一般把DNA 分子切割、分子切割、DNA片段末端修饰和片段末端修饰和DNA片段连片段连接等所用的酶称为工具酶。接等所用的酶称为工具酶。(一)限制性内切酶(一)限制性内切酶限制性内切酶(限制性内切酶(Restriction endonuclease):):是一类以环是一类以环状或线形双链状
4、或线形双链DNA为底物,能识别为底物,能识别DNA中的特定核苷中的特定核苷酸序列,并在合适反应条件下,使每条的一个磷酸二酸序列,并在合适反应条件下,使每条的一个磷酸二酯键断开,产生酯键断开,产生-OH和和5 -P基团基团DNA片段的内脱氧片段的内脱氧核酸酶核酸酶(endodeoxyribonuclease)。(四)逆转录酶(五)RNA聚合酶二、目的基因的载体类型及其功能二、目的基因的载体类型及其功能载体(载体(vector): 能够携带外源基因进入受体细胞能够携带外源基因进入受体细胞的的DNA分子。分子。基因克隆载体必备条件基因克隆载体必备条件:(:(1)受体细胞本来就有)受体细胞本来就有的或
5、受体细胞可以接受的;(的或受体细胞可以接受的;(2)具有能使)具有能使外源外源DNA片段插入的多克隆位点(片段插入的多克隆位点( MCS,multiple cloning site););(3)能进行自我复制,具有复)能进行自我复制,具有复制原点(制原点(ORI,origin );();(4)具有选择标记,具有选择标记,承载外源承载外源DNA片段的载体进入细胞后,以便筛片段的载体进入细胞后,以便筛选克隆子。选克隆子。(一)质粒及其功能(二)噬菌体及其功能(二)噬菌体及其功能(三)考斯质粒(四)动物病毒的载体作用(五)植物寄生菌作为目的(五)植物寄生菌作为目的DNA的载体的载体Ti质粒(质粒(T
6、i plasmid):):是一种细菌质粒,存在于土是一种细菌质粒,存在于土壤农杆菌壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) (革兰氏阴菌)革兰氏阴菌)细胞中细胞中,可可诱导植物产生瘤细胞诱导植物产生瘤细胞( Tumor- inducing, Ti ),冠瘿瘤(冠瘿瘤(grown galltumors)。 诱导植物产诱导植物产生瘤细胞生瘤细胞第二节第二节 DNA重组重组的基本技术步骤的基本技术步骤1、目的基因的制备、目的基因的制备2、目的基因与载体的重组、目的基因与载体的重组3、重组、重组 体导入宿主细胞进行扩增体导入宿主细胞进行扩增4、克隆基因的鉴定、克隆基因的鉴定For
7、eign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+一、目的基因的制备方法一、目的基因的制备方法基因工程的主要目的基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重是通过优良性状相关基因的重组,获得具有高度应用价值的新物种。组,获
8、得具有高度应用价值的新物种。为此,必须从现有生物群体中,根据需要分离为此,必须从现有生物群体中,根据需要分离用于克隆的此类基因,这样的基因通常称为用于克隆的此类基因,这样的基因通常称为目的基目的基因因。(一)建立(一)建立DNA文库文库某种生物基因组全部遗传信息的一系列某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段,片段,通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中,这种通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中,这种包含某生物基因组全部包含某生物基因组全部DNA片段受体菌群体(一套片段受体菌群体(一套克隆)称为这种生物的克隆)称为这种生物的基因组文库基因组文库。 基基因因组组文文库库建建立立顺顺序序基因
9、文库基因文库和和cDNA文库文库的建立的建立组织组织可克隆之可克隆之DNA载体载体DNAcDNAmRNA部分或完全部分或完全酶解酶解DNADNA长度分级长度分级甲基化,双链甲基化,双链接头接头DNADNA与载体连接与载体连接引入大肠杆菌引入大肠杆菌鉴定文库的滴度和特性鉴定文库的滴度和特性扩增后供扩增后供长期储存长期储存筛选出所需筛选出所需要的克隆要的克隆(三)人工合成(三)人工合成DNADNA片段片段(四)聚合酶链式反应(四)聚合酶链式反应(PCR)扩增扩增DNA 1 PCR的原理:的原理:1985年年Mullis发明发明PCR( polymerase chain reaction)快速扩增快
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