dna的生物合成复制（课件）.ppt

1、基因信息传递基因信息传递第第 三三 篇篇山西医科大学山西医科大学生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室 DNA RNA 蛋白质转录翻译复制逆转录RNA复制DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis第第 十十 章章本章内容本章内容第一节第一节 DNADNA复制的特点复制的特点第二节第二节 DNADNA复制的酶学复制的酶学第三节第三节 DNADNA生物合成过程生物合成过程第四节第四节 逆转录逆转录第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复DNA复制的特点复制的特点第一节第一节一、半保留复制一、半保留复制(semiconservative replication)（

2、一）概念（一）概念（二）实验依据：密度梯度实验（二）实验依据：密度梯度实验（三）生物学意义：（三）生物学意义： 1. 1.保证遗传信息传递的忠实性保证遗传信息传递的忠实性 2. 2.遗传和变异的统一遗传和变异的统一密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果二、双向复制二、双向复制(bidirectional replication) 原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从起始点从起始点(orig

3、in)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。的复制叉，称为双向复制。A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C53oriorioriori535533553复制子复制子3三、半不连续复制三、半不连续复制(semi-discontinuous replication)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。行的，这股链称为领头链。另一股链因为

4、复制的方向与解链方向相反，另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。是复制的半不连续性。3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)四、需要四、需要RNA引物引物(primer) DNA聚合酶不能直接聚合

5、游离的聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供必须由一段核酸片段提供3OH末端。末端。DNA复制的酶学复制的酶学第二节第二节一、一、DNA复制的体系复制的体系 （一）底物：（一）底物：dNTP, N=A,T,C,G （二）模板：（二）模板：DNA单链单链 （三）引物：（三）引物： RNA或延长中的或延长中的DNA子链，子链，提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 （四）酶和蛋白质因子：（四）酶和蛋白质因子：(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 二、二、DNA复制的酶学复制的酶学 （一）（一）解螺旋酶解螺旋酶helicase： 可以

6、将可以将DNA双链解开成为单链。大肠双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。（二）（二）DNA拓扑异构酶拓扑异构酶DNA topoisomerase： 通过切断并连接通过切断并连接DNA双链中的一股或双股，双链中的一股或双股，改变改变DNA分子拓扑构象，避免分子拓扑构象，避免DNA分子打结、缠分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。绕、连环，在复制的全程中都起作用。 类型：拓扑异构酶类型：拓扑异构酶I和拓扑异构酶和拓扑异构酶II。拓扑异。拓扑异构酶构酶I能切断能切断DNA双链中一股并再连接断端，反应双链中一股并再连接断端，反应不需不需ATP供能；拓扑异

7、构酶供能；拓扑异构酶II能使能使DNA双链同时双链同时发生断裂和再连接，需发生断裂和再连接，需ATP供能。供能。1010 8 8 局部解链后局部解链后（三）（三）DNA单链结合蛋白单链结合蛋白 single chain binding protein-SSB： 可以维持模板的单链状态并保护模板不可以维持模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解。随着受核酸酶的降解。随着DNA双链的不断解双链的不断解开，开，SSB能不断的与之结合、解离。能不断的与之结合、解离。（四）引物酶（四）引物酶primase： 是一种是一种RNA聚合酶，在复制的起始聚合酶，在复制的起始点处以点处以DNA为模板，催化合成一小

8、段互补为模板，催化合成一小段互补的的RNA。引物酶能直接在单链。引物酶能直接在单链DNA模板上模板上催化游离的催化游离的NTP合成一小段合成一小段RNA，并由这，并由这一小段一小段RNA引物提供引物提供3-OH， 经经DNA聚合聚合酶催化链的延伸。酶催化链的延伸。 （五）（五）DNA聚合酶聚合酶 全称：依赖全称：依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：简称：DNA-pol 活性：活性： 53 的聚合活性的聚合活性 53 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 35 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T

9、A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 1.原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶催化催化DNA聚合聚合参与参与DNA损损伤的应急状伤的应急状态修复态修复修复合成、修复合成、切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞1011亚基数亚基数+-+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性

10、聚合酶活性pol IIIpol IIpol I功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DN

11、A-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 功能功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD) 2.真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性起始引发，有引物酶活性DNA-pol 参与低保真度的复制参与低保真度的复制 DNA-pol 在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用复制中起催化作用DNA-pol 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol 校读、修复和填补缺

12、口校读、修复和填补缺口（六）（六）DNA连接酶连接酶 DNA ligase 连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的段相邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353三、三、DNA复制的保真性复制的保真性（一）酶学依据：（一）酶学依据： 1.核酸外切酶活性和校读；核酸外切酶活性和校读； 2.复制的保真性和碱基选择复制的保真性和碱基选择（二）机制：（二）机制： 1.遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对

13、规律； 2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能； 3.复制出错时有即时的校读功能复制出错时有即时的校读功能DNA生物合成过程生物合成过程第三节第三节一、原核生物一、原核生物DNA生物合成生物合成（一）起始阶段（一）起始阶段 1.辨认起始点，形成单链：辨认起始点，形成单链： 2.合成引发体：合成引发体： 3.合成引物：合成引物：E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-T

14、TTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶

15、酶（二）延长阶段（二）延长阶段复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。生成。 领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成目目 录录复复制制过过程程简简图图目目 录录（三）终止阶段（三）终止阶段 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制，双向复制的复制片段在复制的终止点的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV405005 5 5 RNA酶酶OHP

16、5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接二、真核生物二、真核生物DNA生物合成生物合成（一）（一）DNA的复制只发生在的复制只发生在S期期（二）多复制子（二）多复制子（三）真核细胞含有（三）真核细胞含有5种种DNA聚合酶聚合酶（四）端粒复制（四）端粒复制 染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。引物，去除后留下空隙。5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目目 录录 1.端粒端粒telemer：指真核生物染色体线性：指真核生物染色

17、体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。 2.结构特点：结构特点：（1）由末端单链）由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。（2）末端）末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱碱基的短序列。基的短序列。 3.功能：功能：（1）维持染色体的稳定性）维持染色体的稳定性（2）维持）维持DNA复制的完整性复制的完整性 4.端粒酶：由端粒酶：由RNA和蛋白质组成和蛋白质组成（1）RNA发挥模板作用发挥模板作用（2）蛋白质发挥逆转录酶活性）蛋白质发挥逆转录酶活性端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步

18、加工逆转录逆转录(reverse transcription) 第四节第四节一、概念一、概念 逆转录指遗传信息从逆转录指遗传信息从RNA流向流向DNA，是是RNA指导下的指导下的DNA合成过程，即以合成过程，即以RNA为为模板，四种模板，四种dNTP为原料，合成与为原料，合成与RNA互补的互补的DNA单链。单链。 逆转录逆转录酶酶二、逆转录酶二、逆转录酶(reverse transcriptase) 催化逆转录过程的酶称逆转录酶，催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中都含有此酶。病毒中都含有此酶。 具有三种酶活性：具有三种酶活性： RNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶 RNA酶酶 DNA指

19、导的指导的DNA聚合酶聚合酶三、合成过程三、合成过程 RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成

20、cDNAcDNA complementary DNA DNA损伤与修复损伤与修复第五节第五节一、突变的意义一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础二、引发突变的因素二、引发突变的因素（一）物理因素：（一）物理因素：紫外线紫外线(ultra violet, UV)、 各种辐射各种辐射 UV（二）化学因素：（二）化学因素：常见的化学诱变剂常见的化学诱变剂化合物类别化合物类别作作 用用 点点分子改变分子改变碱基类似物碱基

21、类似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羟胺类（羟胺类（NH2OH）T C- T - A - C - G -亚硝酸盐（亚硝酸盐（NO2）C U- G - C - A - T -烷化剂烷化剂如：氮芥类，如：氮芥类，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型（一）错配（一）错配 (mismatch) DNA分子上的碱基错配称点突变分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。 1.转换：转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。另一嘌呤，或嘧啶代替另

22、一嘧啶。 2.颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。啶或嘧啶变嘌呤。镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因（二）（二）缺失缺失 (deletion)、插入、插入 (insertion) 1.缺失：一个碱基或一段核苷酸链从缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大大分子上消失。分子上消失。 2.插入：原

23、来没有的一个碱基或一段核苷酸插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到链插入到DNA大分子中间。大分子中间。 3.缺失或插入都可导致框移缺失或插入都可导致框移(frame-shift)突突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。变。谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突变缺失引起框移突变（三）重组（三）重组(recombination) DNA分子内

24、较大片段的交换，称为重分子内较大片段的交换，称为重组或重排。组或重排。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型目目 录录四、四、DNA损伤的修复损伤的修复（一）（一）光修复光修复(light repairing)光修复酶光修复酶(photolyase) UV（二）切除（二）切除修复修复(excision repairing) 是细胞内最重要和有效的修复机制，主是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由要由DNA-pol和连接酶完成。和连接酶完成。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHPDNA连接酶连接酶ATPE.coli的的切切除除修修复复机机制制（三

25、）重组（三）重组修复修复(recombination repairing)（四）（四）SOS修复修复当当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。诱发出一系列复杂的反应。在在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。导致较广泛、长期的突变。