DNA的生物合成(生物化学课件).ppt
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- 生物化学课件 DNA 生物 合成 生物化学 课件
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1、1生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室 刘先俊刘先俊23一、一、DNADNA半保留复制的概念及其实验证据半保留复制的概念及其实验证据 在在DNADNA复制过程中,复制过程中,DNADNA双螺旋结构的双螺旋结构的两条多核苷酸链彼此分开,然后,每条链两条多核苷酸链彼此分开,然后,每条链各自作为模板,在其上分别合成出一条互各自作为模板,在其上分别合成出一条互补链,这样,新形成的两个补链,这样,新形成的两个DNADNA分子(子代分子(子代DNADNA)与原来)与原来DNADNA分子(亲代分子(亲代DNADNA)的核苷酸)的核苷酸序列完全相同。在此过程中,每个子代序列完全相同。在此过程中
2、,每个子代DNADNA的两条链,一条来自亲代的两条链,一条来自亲代DNADNA,另一条链则,另一条链则是新合成的,这种方式称为是新合成的,这种方式称为DNADNA的半保留复的半保留复制制 。 4子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 5 1953 1953年,年,WatsonWatson和和CrickCrick在提出在提出DNADNA双螺旋双螺旋结构模型的同时,即提出结构模型的同时,即提出DNADNA是通过半保留复是通过半保留复制制19581958年,年,MeselsonMeselson和和StahlStahl通过
3、实验证实了通过实验证实了“半保留复制半保留复制”的设想。的设想。 首先将大肠杆菌置于含首先将大肠杆菌置于含1515NHNH4 4ClCl的培养基中的培养基中培养若干代后,使大肠杆菌培养若干代后,使大肠杆菌DNADNA全部成为全部成为1515N-N-DNADNA(由于大肠杆菌生长繁殖过程中,需要利(由于大肠杆菌生长繁殖过程中,需要利用培养基中的用培养基中的N N作为氮源以合成其作为氮源以合成其DNADNA或或RNARNA等等含氮物质,在仅提供含氮物质,在仅提供1515N N的情况下,大肠杆菌合的情况下,大肠杆菌合成的成的DNADNA必然为必然为1515N-DNAN-DNA)。)。6 普通大肠杆菌
4、为普通大肠杆菌为1414N-DNAN-DNA,1414N N和和1515N N是是N N元素的两种非放射性同位素,其中,元素的两种非放射性同位素,其中,1515N N比比 1414N“N“重重”。当分别提取出其相应。当分别提取出其相应DNADNA后,在后,在进行进行CsClCsCl等密度梯度离心时,等密度梯度离心时,1515N-DNAN-DNA与与1414N-N-DNADNA由于两者由于两者“重量重量”的差别而位于离心管的差别而位于离心管不同位置,前者称为不同位置,前者称为“重重”DNADNA,后者称为,后者称为“轻轻”DNADNA。因而可通过密度梯度离心而区。因而可通过密度梯度离心而区分开来
5、。分开来。 随后,再将含随后,再将含1515N-DNAN-DNA的大肠杆菌置于的大肠杆菌置于含含1414N N的培养基中培养,此后,在不同时间的培养基中培养,此后,在不同时间(第一代、第(第一代、第2 2代、第代、第3 3代代等)取样进等)取样进行密度梯度离心。其结果是:行密度梯度离心。其结果是:78第第 1 1 代 : 出 现代 : 出 现 1 1 条条 D N AD N A 带 , 其 位 置 既 非带 , 其 位 置 既 非“轻轻”DNADNA带也非带也非“重重”DNADNA带的位置,而带的位置,而处于两带之间的中间位置。处于两带之间的中间位置。第第2 2代:出现代:出现2 2条条DNA
6、DNA带,其中一条的位置与第带,其中一条的位置与第1 1代的位置相同(即处于代的位置相同(即处于“轻轻”带和带和“重重”带之间的中间位置),另一条出现在带之间的中间位置),另一条出现在“轻轻”DNADNA带的位置。带的位置。第第3 3代:于第代:于第2 2代类似,也出现代类似,也出现2 2条条DNADNA带,其带,其位置与第位置与第2 2代相同,即一条中间位置的带和代相同,即一条中间位置的带和一条一条“轻轻”带,但带,但“轻轻”带的带的DNADNA更多了。更多了。第第4 4代及以后:均为代及以后:均为2 2条条DNADNA带,其位置与第带,其位置与第2 2代、第代、第3 3代相似,但代相似,但
7、“轻轻”带的带的DNADNA越来越越来越多,而中间位置带的多,而中间位置带的DNADNA越来越少。越来越少。910 为了证实为了证实DNADNA分子中只有一条是新合成分子中只有一条是新合成的,的,MeselsonMeselson和和StahlStahl将提取出的第将提取出的第1 1代大代大肠杆菌肠杆菌DNADNA加热处理,使其变性后仍通过加热处理,使其变性后仍通过CsClCsCl超速离心分离,在紫外吸收扫描图上超速离心分离,在紫外吸收扫描图上可见两个比重不同的紫外吸收峰,从而确可见两个比重不同的紫外吸收峰,从而确证了第证了第1 1代细菌的代细菌的DNADNA是由两条比重不同的是由两条比重不同的
8、链所组成,排除了其它可能性。链所组成,排除了其它可能性。1112半保留复制的意义半保留复制的意义 按半保留复制方式,子代按半保留复制方式,子代DNA与亲代与亲代DNA的碱基序列一致,即子代保留了亲代的碱基序列一致,即子代保留了亲代的全部遗传信息,体现了遗传的保守性。的全部遗传信息,体现了遗传的保守性。 遗传的保守性,是物种稳定性的分子基遗传的保守性,是物种稳定性的分子基础,但不是绝对的。础,但不是绝对的。1314151617181.1.前导链前导链192.2.随从链随从链203.3.岗崎片段岗崎片段214.4.半不连续复制半不连续复制22(三)双向复制(三)双向复制 原核生物复制时,原核生物复
9、制时,DNADNA从从起始点起始点(origin)(origin)向两个方向解链,形向两个方向解链,形成两个延伸方向相反成两个延伸方向相反的复制叉,称为双向的复制叉,称为双向复制。复制。复制中的复制中的DNADNA成成为为 状。状。 2324真核生物每个染色体有多个起始点,是多复真核生物每个染色体有多个起始点,是多复制子的复制。制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个定为一个复制子复制子(replicon(replicon) ) 。复制子是独。复制子是独立完成复制的功能单位。立完成复制的功能单位。252627(一)(一)DNADNA聚合酶聚合酶 D
10、NADNA聚合酶(聚合酶(DNA polymeraseDNA polymerase)在有)在有DNADNA模板存在时,可催化合成模板存在时,可催化合成DNADNA,因此,因此,又 称 为又 称 为 D N AD N A 指 导 的指 导 的 D N AD N A 聚 合 酶 (聚 合 酶 ( D N A -D N A -directed DNA polymerasedirected DNA polymerase,DDDPDDDP)。)。1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶( (原核生物原核生物) ) 1956 1956年,年,KornbergKornberg等人首次从大肠杆等人首次
11、从大肠杆菌的提取液中发现了一种能催化合成菌的提取液中发现了一种能催化合成DNADNA的的酶,称为酶,称为DNADNA聚合酶聚合酶。28目前研究表明,大肠杆菌目前研究表明,大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶有三种功有三种功能:能:第一、第一、5353的聚合作用。的聚合作用。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶酶只能在引物的只能在引物的33端加上脱氧核苷酸,它端加上脱氧核苷酸,它是利用引物的是利用引物的3-OH3-OH与待加入的脱氧核苷三磷与待加入的脱氧核苷三磷酸的酸的5-5-磷酸基之间形成磷酸基之间形成3,5-3,5-磷酸二酯磷酸二酯键。已加入的脱氧核苷酸则仍有一个游离的键。已加入的脱氧核苷酸则
12、仍有一个游离的3-OH3-OH,又可与下一个脱氧核苷三磷酸的,又可与下一个脱氧核苷三磷酸的55磷酸基之间形成磷酸基之间形成3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键, ,以后,以后,按这种方式,按这种方式,DNADNA链不断延伸,因此,新链的链不断延伸,因此,新链的合成方向是合成方向是5353,称为大肠杆菌,称为大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶酶的的5353聚合作用。聚合作用。2930第二、第二、3535的外切作用的外切作用(35exonuclease action35exonuclease action) 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶除具有除具有5353的的聚合作用外,也能催化从聚合作用
13、外,也能催化从3-3-末端水解末端水解DNADNA链,链,而产生游离的单核苷酸,称为而产生游离的单核苷酸,称为3535的外切的外切作用。其作用。其3535的外切作用对的外切作用对DNADNA的聚合具有的聚合具有校正功能校正功能。错位接上去的碱基。错位接上去的碱基C C会被会被DNADNA聚合酶聚合酶的的3535的外切作用水解掉,而的外切作用水解掉,而DNADNA聚合酶聚合酶再催化重新聚合上正确的碱基再催化重新聚合上正确的碱基T T。3132第三、第三、5353的外切作用。的外切作用。 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶还具有还具有5353的外切的外切作用。但这种外切作用不同于其作用。但这
14、种外切作用不同于其3535的外切的外切作用:作用:(1 1)首先,其裂解的键必须位于双螺旋区域。)首先,其裂解的键必须位于双螺旋区域。(2 2)其次,产物为单核苷酸或几个碱基组成的寡聚)其次,产物为单核苷酸或几个碱基组成的寡聚体。体。(3 3)5353的外切作用随着的外切作用随着DNADNA合成的进行而不合成的进行而不断增强。断增强。(4 4)5353的外切作用的酶的活性部位可与其聚的外切作用的酶的活性部位可与其聚合作用和合作用和3535的外切作用的活性部位分开。的外切作用的活性部位分开。 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的的5353外切作用外切作用在在DNADNA复制过程中用于复制过
15、程中用于去除引物去除引物。 333435 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶分子量为分子量为109kD109kD,是,是含有含有928928个氨基酸残基的单条肽链。若用枯草个氨基酸残基的单条肽链。若用枯草杆菌蛋白酶处理,可将大肠杆菌杆菌蛋白酶处理,可将大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶水解为大小不等的两个片断,其中,分子量较水解为大小不等的两个片断,其中,分子量较小的为小片断,其分子量为小的为小片断,其分子量为33kD33kD,它有,它有5353的外切作用;另一个分子量较大的称的外切作用;另一个分子量较大的称为大片断,其分子量为为大片断,其分子量为76kD76kD,它有,它有5353聚聚合
16、作用和合作用和3535的外切作用,大片断又称为的外切作用,大片断又称为KlenowKlenow片断(片断(KlenowKlenow fragment fragment)。)。36 可见,大肠杆菌可见,大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的结构功的结构功能区可表示如下:能区可表示如下: 53 35 53 外切作用 外切作用 聚合作用 53 35 53 外切作用 + 外切作用 聚合作用 小片断小片断 大片断大片断C枯草杆菌蛋白酶N37 继继DNADNA聚合酶聚合酶之后,之后,19701970、19711971年又分别从年又分别从大肠杆菌中发现了另外大肠杆菌中发现了另外2 2种种DNADNA聚合酶,分别
17、命名聚合酶,分别命名为为DNADNA聚合酶聚合酶、。现将三种大肠杆菌。现将三种大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶的主要特性列于下表中。酶的主要特性列于下表中。三种大肠杆菌三种大肠杆菌DNADNA聚合酶的主要特性比较聚合酶的主要特性比较DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶功能:53聚合作用+ 35外切作用+ 53外切作用+-分子量(kD)109120250细胞中存在的比例4004020聚合速度(bp/min/分子,37)1,0005015,000细胞内的主要作用校正复制错误填补复制、修复中的空隙参与应急状态的DNA修复DNA复制382. 2. 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-po
18、lDNA-pol 起始引发、有引物酶活性起始引发、有引物酶活性DNA-polDNA-pol 低保真低保真DNADNA复制复制DNA-polDNA-pol 线粒体线粒体DNADNA的复制的复制DNA-polDNA-pol 复制中延长子链、解螺旋酶复制中延长子链、解螺旋酶DNA-polDNA-pol 修复和填补缺口修复和填补缺口39(二)引物酶(二)引物酶 引物酶(引物酶(primaseprimase)是一种特殊的是一种特殊的RNARNA聚合聚合酶。在酶。在DNADNA复制过程中,复制过程中,DNADNA聚合酶催化合成聚合酶催化合成DNADNA时,需要一段带有时,需要一段带有3-OH3-OH末端的
19、低聚核苷末端的低聚核苷酸单链(体内为一小段酸单链(体内为一小段RNARNA)作引物)作引物(primerprimer),引物的碱基序列与模板),引物的碱基序列与模板DNADNA呈互呈互补结合,引物的长度在原核生物如大肠杆菌通补结合,引物的长度在原核生物如大肠杆菌通常只有常只有1 16 6个碱基,在真核生物,通常也只有个碱基,在真核生物,通常也只有1010个碱基左右。引物酶的作用即是利用四种核个碱基左右。引物酶的作用即是利用四种核苷三磷酸(简称苷三磷酸(简称NTPNTP)为底物,根据模板的碱)为底物,根据模板的碱基序列,按照碱基配对规则合成一小段基序列,按照碱基配对规则合成一小段RNARNA引引
20、物。物。40引物酶引物酶 (primase(primase):): 依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶。聚合酶。 催化带有催化带有3-OH3-OH末断的末断的RNARNA引物的合成。引物的合成。 引发体引发体 (primosome(primosome):): 是由是由DnaDna B B、DnaDna C C、引物酶、引物酶、DNADNA复制复制起始区等一起形成的复合体。起始区等一起形成的复合体。 引发体形成后,在引发体形成后,在ATPATP提供能量时,引提供能量时,引物酶以物酶以DNADNA作为模板而合成引物。作为模板而合成引物。4142(三)解链、解旋酶类(三)解链、解旋酶类 解开
21、并理顺解开并理顺DNADNA双链,维持双链,维持DNADNA处处于单链状态。主要有解螺旋酶、于单链状态。主要有解螺旋酶、DNADNA拓拓扑异构酶和单链扑异构酶和单链DNADNA结合蛋白。结合蛋白。431. 1. 解螺旋酶解螺旋酶 (helicase(helicase) : ) : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对,而碱基却埋在双螺旋的内部。只有配对,而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把把DNADNA解开成单链,它才能起模板作用。解开成单链,它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质,当时称为蛋白质,当时称为re
22、prep蛋白。作用是利用蛋白。作用是利用ATPATP供能,解开供能,解开DNADNA双链。双链。442. 2. 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白 (SSB) :(SSB) : SSBSSB曾被称为螺旋反稳定蛋白(曾被称为螺旋反稳定蛋白(HDPHDP)。)。在大肠杆菌,它是由在大肠杆菌,它是由177177个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成的同四聚体,结合单链的同四聚体,结合单链DNADNA的跨度约的跨度约3232个核个核苷酸单位。苷酸单位。SSBSSB与解开的与解开的DNADNA单链紧密结合,防止单链紧密结合,防止 重新形成双链,并免受核酸酶降解。在复重新形成双链,并免受核酸酶降解。在复制中维
23、持模板处于单链状态。制中维持模板处于单链状态。453. DNA3. DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase(topoisomerase) :) : 拓扑:是指物体或图像作弹性移位而又保拓扑:是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。持物体不变的性质。拓扑异构酶:是一类可改变拓扑异构酶:是一类可改变DNADNA拓扑性质拓扑性质的酶。对的酶。对DNADNA分子的作用是既能水解、又分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。可松弛能连接磷酸二酯键。可松弛DNADNA超螺旋,超螺旋,有利于有利于DNADNA解链。解链。4647拓扑异构酶拓扑异构酶I I(topotopo I I)
24、: : 在原核生物曾被称为在原核生物曾被称为 蛋白。蛋白。 主要作用是主要作用是将超螺旋将超螺旋DNADNA双股中的一股切断,双股中的一股切断,酶仍停留在酶仍停留在33断端,使链的末端沿着螺旋断端,使链的末端沿着螺旋轴按超螺旋的反方向转动,轴按超螺旋的反方向转动, DNADNA变为松弛变为松弛状态(状态(超螺旋消除后)超螺旋消除后)再封闭切口再封闭切口。催化。催化反应不需要反应不需要ATPATP。48拓扑异构酶拓扑异构酶IIII( topotopo II II): : 在原核生物又叫旋转酶在原核生物又叫旋转酶(gyrase(gyrase) )。连接断端。连接断端。 无无ATPATP参与时,使螺
25、旋松弛。参与时,使螺旋松弛。 在在ATPATP参与下,松弛的参与下,松弛的DNADNA进入负超螺进入负超螺旋。旋。49(四)(四)DNADNA连接酶连接酶 可催化可催化DNADNA链内缺口通过链内缺口通过3,5-3,5-磷酸磷酸二酯键连接起来,在此过程中,需要消耗二酯键连接起来,在此过程中,需要消耗能量。该能量的提供者是能量。该能量的提供者是ATPATP(动物细胞、(动物细胞、噬菌体)或噬菌体)或NADNAD+ +(细菌)。(细菌)。5051525354(一)原核生物(一)原核生物DNADNA复制过程复制过程5556DNADNA复制的起始就是要解开双链和生成引物。复制的起始就是要解开双链和生成
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