RNA合成2005.6 生物化学　教学课件.ppt

1、内容概要：第一节 依赖DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二、模板链与非模板链三、E.coli RNA聚合酶的组成与功能特征四、转录的基本过程第二节 RNA合成的起始小 结第三节 RNA合成的终止第四节 真核生物细胞核RNA聚合酶第六节 以RNA为模板的DNA和RNA合成第五节 新生RNA的剪切和修饰第十二章 RNA的生物合成引 言生物遗传信息传递的化学本质，在分子水平看就是：DNARNA复制本质：遗传信息全部传递给子代DNA分子。随分裂DNA进入子细胞，通过表达的蛋白质控制生长发育。蛋白质转录翻 译蛋白质是生命活动的体现者，不同时期DNA表达不同蛋白质从而控制整个生命活动过程。在生物体体系DN

2、A如何指导RNA合成？第一节 原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶催化RNA合成的酶RNA聚合酶全称：依赖DNA的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase)，简称RNA聚合酶(RNA polymerase)。又称为转录酶(transcriptase)。n1ATPn2GTPn3CTPn4UTPDNA(模板)，Mg2+RNA聚合酶RNA+(n1+n2+n3+n4)PPiRNA聚合酶催化如下的反应:RNA合成中底物或原料转录最大特点：信息传递具有选择性转录时DNA两条链中只有其中一条链作模板； 因为转录 的RNA只能与变性DNA中的一条链形成杂种分子。转录的RNA仅拷贝

3、了DNA中的某个片段的信息(部分功能单位-基因)；处于转录过程的DNA和正在被合成的RNA用图示意如下:新合成RNA模板链非模板链历时近半个世纪已经解决的基本问题：1、RNA聚合酶如何催化RNA合成？2、此时此刻被转录的信息由谁来识别？3、RNA合成基本过程如何？ Uchoa(西班牙)Kornberg因基因表达研究富有成果分享1959年诺贝尔医学奖； 1965年Jacob Monod(法)提出并证实操纵子学说与woff分享诺贝尔医学奖； 1975年Tiemin Baltimore由于发现肿瘤病毒逆转录酶，共享诺贝尔生理医学奖；DNARNA聚合酶E.coli 中正在工作的RNA聚合酶催化的转录过

4、程:转录泡17bp模板链(非编码链) RNA5非模板链(编码链)RNA-DNA 杂螺旋活性位点：RNA3端逐个添加NMP；速度：5090nt/sRNA合成方向53 RNA聚合酶沿模板链从35移动AGTCOOOpOO3AGTCOOOO5ppppppp模板DNAAUCOOO5pppOpppAOHppOHGOpOHppUOpOHRNA聚合酶在引物3-OH上添加单核苷酸催化机理：进位的NTP受活性中心模板上碱基限制：互补原则决定进位的核苷三磷酸和被添加在3-端的核苷酸种类。进位后聚合酶作用下形成3-磷酸酯键，单核苷酸被添加上。RNA聚合酶活性中心用于指导RNA合成的链叫模板链，也称为负链或无意义链。互

5、补于模板链的DNA链叫非模板链，也叫正链或有意义链。5GACAACTTGAGAACCG 3非模板链（编码链）3CTGTTGAACTCTTGGC5 模板链5AACUUGAGAA 3RNA二、模板链与非模板链DNARNA聚合酶全酶： 亚基基因相对分子量 组分功 能 rpoA rpoB rpoC rpoD rpoE 4.0 104 1.55 105 1.6 105 8.5 104 1.1 104核心酶核心酶核心酶因子 结合启动子区 结合核苷酸 结合膜板DNA 负责转录起始 不明每个分子含5个亚基：2 -核心酶(core enzyme)；-起始因子 三、E.coli RNA聚合酶的组成与功能特征四、转

6、录的基本过程起始RNA聚合酶从起始位点开始转录，合成pppNpN后，因子解离。延伸由核心酶完成。 核心酶延伸核心酶沿DNA模板链从35移动在反应中心于RNA 3逐个添加核苷酸。终止终止核心酶遇到终止子后，RNA自动脱离核心酶或在因子帮助下脱离核心酶，终止合成。复制起始:RNA合成起始位点与其上游存在的聚合酶识别位点、结合位点构成的特有DNA序列。DNA模板链对RNA合成起指导作用的第一个碱基计为+1区；也叫起始位点；在编码链中一般为A或G。5GCCAUGAATTGACACCAGAGCCGGAAAGAACATATAATCACCACACCAACGA3DNA编码链起始位点正区负区下游上游-10区(称

7、为Pribnow框70因子紧密结合区)-35区(识别区，即70因子识别结合区)启动子：DNA分子中用于转录起始的三个特殊碱基序列构成。核心酶pppApN3OHRNA合成起始，脱离核心酶，后续的RNA合成由核心酶完成大肠杆菌因子的编码基因及启动子的特征703254起始因子启动基因功能35区核心序列序列长度10区核心序列 rpoDrpoHrpoNTTGACATCTCNCCCTTGAACTGGNA许多热休克参与氮代谢161813156TATAATCCCATNTATTGCA 因子 被启动基因 功能 35区 间距 10区 70 rpoD 许多 TTGACA 1618 32 rpoH 热休克 TCTCNC

8、CCTTGAA 1315 54 rpoN 参与氮代谢 CTGGNA 6RNA合成的终止真核生物中转录终止过程仍不清楚，在E.coli染色体DNA中已知的至少有两种终止信号：1、具有转录成自身互补序列的区域，它能在RNA链末端之前1520个核苷酸为中心处形成一个发夹式结构，该结构能够的形成能打断转录复合物中的RNA-DNA杂交部分，使RNA从整个复合物解离。不依赖于因子的终止子有两个特性：依赖于因子(蛋白质)的终止子；不依赖于因子的终止子。2、由模板链上polyA转录而成的RNA3端具有polyU序列RNA-polyU与DNA-polyA结合很不稳定，很容易从模板DNA上解离而终止合成。CCCA

9、CACCCGGCGCCTAATGAGCGCCGATTTTTTTTGGGTGT GGGCCGCGGAT TAGTCGCGGCTAAAAAAA3355回文结构富含GC区模板链转录方向UUUUUUUUpolyUAAUUGAC3OH5富含G CCGCGGCGCGCCGC C A发夹结构ACUGAGGA非polyUAAUUGAC3OH5不富含G:CAGAUGAUCUACUC C A发夹结构不依赖于因子的终止信号转录的RNA依赖于因子的终止信号转录的RNA富含AT区53AAAAAAU35AAAAAAUUUUUU35不依赖于因子的终止信号终止过程UUUUUU 不依赖于因子终止信号中的polyU与模板结合疏松

10、，会使得RNA与模板结合不牢固很容易从复合体解离。依赖于因子的终止信号则没有polyU，因此需要因子帮助才能使合成的RAN从核心酶上脱落。 因子能沿着RNA从53滑动至核心酶中心，使合成的RNA从模板上解离。UUUUUU53CGATAGG35CGATAGGCUAUC35依赖于因子的终止信号终止过程 不依赖于因子终止信号中的polyU与模板结合疏松，会使得RNA与模板结合不牢固很容易从复合体解离。依赖于因子的终止信号则没有polyU，需要因子帮助才能使合成的RAN从核心酶上脱落。因子能沿着RNA从53滑动至核心酶中心，使合成的RNA从模板上解离。GCUAUC第二节 真核生物核的RNA合成负责核糖

11、体rRNA18S、5.8S、28S的前体合成1.全酶结构比原核生物的复杂，起始因子(因子)种类多；2.已发现的有聚合酶有三种；合成过程与原核细胞基本相同；3.线粒体中具有不同于原核生物中的RNA聚合酶(小分子)。一、真核生物RNA聚合酶特点主要功能 -1RNA polase合成mRNA前体及大多数snRNA合成5s rRNA前体和一些小RNA前体存在核仁核质核质-2合成tRNA前体核质二、真核细胞与原核细胞转录主要区别1.真核细胞中RNA聚合酶为聚合酶、和，并具有高 度的分工，不同的聚合酶负责合成不同的RNA。2.真核细胞启动子比原核细胞启动子更复杂和更多样性，不同的RNA聚合酶能识别不同的启

12、动子。RNA聚合酶、和 分别识别、和 类启动子。RNA聚合酶识别的类启动子主要包括4个部位：碱基大多数为A-T碱基对 25区富含AT的7个核苷酸。类似于原核启动子10区的Pribnow。 75区的共有序列:GGNCAATCT，其中N为C或T。100或更远的、增强转录速率的短在序列。转录起始部位:TATA框(TATAbox):CAAT框(CAATbox):增强子(enhancer):RNA polase 合成mRNA前体及大多数snRNA核质真核生物RNA聚合酶的启动子结构调节序列TATAAA起始位点53GGCCAATCT+1区起始位点上游或下游附近特殊的序列启动子-75区-25区3.原核细胞靠

13、RNA聚合酶本身识别启动子，而真核细胞的RNA无法识别启动子，要靠转录因子(transcription factor,TF)识别启动子。转录因子( transcription factor,TF)是指参与转录起始有关的一类功能蛋白质。转录因子的功能是与启动子结合，通过蛋白质与蛋白质的相互作用，将RNA聚合酶锚于启动子处，促进基因转录。真核细胞转录因子对应于RNA聚合酶、和，分别称为TF、TF和TF。其中TF种类较多，功能复杂，但研究也较深入。现在已经发现的TFA、TFB、TFC、TFD、TFE、TFF、TFH、TFJ等。TF( transcription factor)的功能:TF ( tra

14、nscription factor)的种类:TFA-J是能识别结合TATA序列附近的蛋白质因子，称为通用转录因子(general factors,GTF)，或称为基本转录因子(basal transcription)。通用转录因子(basal transcriptional activators)可以与启动子附近或远离启动子的顺式原件结合，调控转录起始复合物的组装过程。这些因子有明显的DNA结合域和激活转录所需要的激活结构域。启动子特异转录激活因子(promoter-specfictranscriptional activators)通用基因转录准确起始必须因子，即在一般情况下他们都参与基因组

15、成性表达。通用基因：糖一般代谢、脂类一般代谢、蛋白质一般代谢所有酶等蛋白质的编码基因。这些特异性转录因子在受生物胁迫(病源菌侵入)或非生物胁迫(热击、冷害、干旱、重金属毒害)时，才会调节和控制某些基因表达。即调控基因上游应答元件，如热击应答元件(heat shock response element,HSE)、金属应答原件(metal response element，MRE)等。TATA(关键亚基TBP)框结合蛋白与TFD结合，稳定TFD与TATA结合桥连蛋白:是TBP与TFF-pol结合的桥梁真核pol在转录因子作用下形成转录起始复合物过程:53TATAAA起始位点GGCCAATCTTFD

16、(TBP)TFATFBTFHTFJpolTFFTFE真核生物RNA聚合酶转录过程所需的转录因子组成及功能转录因子转录因子 亚基数亚基数 Mr (kd) 功功 能能起始阶段RNA聚合酶 12 1022 催化RNA合成TBP（TATA盒 1 38 专门识别TATA盒子结合蛋白）TFA 3 12，19，35 稳定TFB和TFP对启动子的结合TFB 1 35 结合于TFP；组装Pol-TFF复合物TFD 12 1525 能与正调节、负调节蛋白相互作用TFE 2 34，57 组装TFH；ATP和解旋酶活性TFF 2 30，74 紧密结合于Pol，结合TFB，防止 RNA聚合酶结合于非特异DNA顺序TFH

17、 12 3589 启动子DNA解螺旋，磷酸化RNA聚合 酶，组装核苷酸切割修复复合物；顺式作用元件(cis-acting element)，亦称应答元件(response element) 。这些元件包括启动子、增强子(enhancer)、和沉默子(silencer)等。4.真核生物的转录受许多特定的顺式作用元件(cis-acting element)和反式作用因子(trans-acting factors)的影响。顺式作用元件的本质是存在启动子附近的短在DNA特有序列，对于转录启动和调控产生影响的核苷酸序列。顺式作用元件TATAAA起始位点-25区TATA盒子能控制转录的忠实性。53GGCC

18、AATCT-75区CAAT框能决定转录的起始频率。+1区调节基因表达活性决定启动频率也决定打开或沉默。顺式作用元件只有与反式作用因子(特有蛋白质)结合才能对转录启动频率或速度产生影响。下游上游增强子增强子(enhancer)位于上游，距离起点至少100bp以上，是一种远程控制元件，又称为上游激活序列(upstream activator sequence,UAS)，它通过启动子来增强转录频率。增强子区由812bp的“核心”元件组成，共有序列为：TGGAAAG/TA/TA/T增强子结构一般特点:一般具有完整或部分回文序列结构，并以单拷贝或多拷贝的形式存在；通常距离+1区14kb，甚至在+1区的3

19、kb之外起作用。近年来已经证明，UAS通过以下方式起作用：影响超螺旋密度，使DNA双螺旋弯曲，改变模板的整体结构，便于转录起始。通过增强子可把模板固定在细胞内特定的位置，如连接在核基质上，以利于拓扑异构酶改变DNA双螺旋的张力，促进RNApoly在DNA链上结合滑动。可为RNApoly或其他重要蛋白质因子提供与染色质结合的“进入位点”。第三节 转录后加工一、原核生物转录后加工原核生物mRNA一经转录不需要加工、修饰就具有模板活性，但是tRNA和rRNA的原初转录产物均需要经过一系列加工，才能成为活性分子。主要包括剪切、剪接形成5-端和3-端的特殊结构、碱基修饰、改变糖苷酸等过程。1.原核rRN

20、A前体的加工E.Coli的rRNA前体分子沉降系数为30S(P30)，大约含6300个核苷酸残基。需要经过修饰、剪切、剪接形成16SrRNA、23SrRNA和几个tRNA。整个过程可以简单图示如下：16S rRNA23S rRNA4StRNA5SrRNA(1)甲级化作用(2)RNase(3)RNaseEEE剪切16S rRNA23S rRNA4StRNA5SrRNAP16Per-tRNAP23P530SRNA专一核酸酶内切酶甲级化常见形式2-甲级核糖16SrRNA特有甲级化N4,2-O-甲级胞嘧啶(m4Cm)2.原核tRNA前体的转录后加工E.Coli染色体基因组共有tRNA的基因约60个，除

21、少数几个与rRNA一起转录，其余的大多数成族排列，转录成含两个或多个tRNA的前体，再进行加工。tRNA前体加工包括：核酸内切酶剪切；核酸外切酶从3-端逐个切去附加顺序，进行修剪；在tRNA3-端添加CCCA-3OH；核苷酸的修饰和异构化。RNase与DNA内切酶不同，RNase不能识别特异序列，它所识别的是加工部位的空间结构。Per-tRNA加工、修饰工程简图示意如下：RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseFRNaseD异构化酶异构化酶CCA3-OHCCA3-OHtRNA前体加工过程中的核酸内切酶RNaseP 能切出成熟5-端的内切酶RNaseF 加工tRNA3-端的核酸

22、内切酶RNaseD tRNA3-端成熟的核酸外切酶tRNA核苷酰基转移酶per-tRNACCA3-OH5加工修饰二、真核生物转录后的加工1.前体mRNA的加工原核生物大多数是含有几个遗传信息的多顺反子mRNA，仅有少数为单顺反子mRNA，由于转录与翻译过程偶联所以大多数原核生物mRNA大多不需要加工就直接进入翻译阶段。只有少数多顺反子mRNA需要加工，即需要剪切成小单位后，再进行翻译。真核生物的基因在DNA上是间隔排列的，这称为断裂基因。但是转录时间隔部分是被一起转录成前体RNA，必须经过剪切和剪接以除去内含子序列，转变成成熟的mRNA后，才能进一步实施后续的蛋白质翻译。3-端添加polyA，

23、5-端戴帽，碱基甲级化修饰等。mRNA初级转录本转录过程中或完成后在核内进行5端加帽子外显子内含子外显子m7Gppp核内3端加多聚A尾，胞质中也有相应酶系，还可以继续延长尾巴m7GpppAA(A)Na-OHmRNA前体剪切去除内含子，拼接外显子m7GpppAA(A)a A-OH转运核质胞质可翻译的mRNAm7GpppAA(A)a A-OH成熟的mRNA核膜孔甲基化，RNA编辑2. 前体rRNA加工rRNA基因是多拷贝的，如原核生物基因中rNRA基因有510拷贝；真核生物中rNRA拷贝数更多，如果蝇为260拷贝。而且rRNA基因是由非转录区(spacer)将它们间隔开来。在每一个rRNA基因内，

24、包含34段rRNA的编码区，其间也有间隔区。间隔区有一些是无转录功能的，另有一些间隔区的转录产物是tRNA。16SrRNAtRNA23SrRNAtRNA5SrRNA35RNase53RNA初级转录本核酸酶53 5335353516SrRNAtRNA23SrRNAtRNA5SrRNARNAs前体成熟RNAs第四节 以RNA为模板的DNA和RNA合成一、逆(反)转录酶一些感染动物细胞的病毒含有存在与病毒颗粒中的反转录酶(reverse transcriptase)，这是一种依赖RNA的DNA聚合酶。感染后，单链RNA病毒基因组(约10000核苷酸长)和酶一起进入宿主细胞。反转录酶催化互补于病毒的一

25、条DNA链的合成，形成RNA-DNA杂种分子，该酶同时能降解其中的RNA链，进一步合成另一条DNA链。双链DNA经常被整合入真核细胞的基因组中。在一定条件下该基因可被激活和转录，它的基因产物-病毒蛋白和病毒RNA一起包装产生新的病毒。含有逆转录酶的RNA病毒叫逆病毒。RNA逆转录转录蛋白质翻译DNA复制复制逆转录酶逆转录酶(RNaseH)病毒RNA35依赖RNA的DNA聚合作用降解RNA-DNA杂种分子中的RNA(即RNaseH活性)依赖DNA的DNA聚合活性整合到寄主DNA中，适当的条件下激活而病变病毒RNA355cDNA3cDNA3535cDNA5353二、逆转录病毒引起癌症或爱滋病癌症发

26、病的分子机制研究证明，逆病毒起着重要的作用。绝大多数逆病毒不杀伤它们的寄主细胞，它们整合到细胞DNA上并随之一起复制。然而，一些病毒有一额外的基因可使细胞癌变(生长异常)。这种病毒被归类为RNA肿瘤病毒。Peyton Raous第一个研究的逆病毒是鸡肉瘤病毒(命名为劳氏肉瘤病毒)，这种病毒和其他肿瘤病毒中的导致肿瘤的基因叫做致癌基因(oncongen)。自从Harold VarmusMichael Bishop发现致癌基因以来，在逆病毒中已经发现十几种不同的这类基因。人类获得性免疫缺陷病毒(human immunondeficience virus,HIV)。这种艾滋病(AIDS病)的致病因子

27、也是一种逆病毒。HIV杀死淋巴细胞，逐渐导致寄主免疫系统的抑制，而不是引起肿瘤，大部分治疗HIV感染的个体所用的药物的靶子是反转录酶。 1、E.coliRNA聚合酶全酶：2，既能识别启动子，又能 起始合成，不需要引物，合成起始后因子脱离核心酶，后续的延伸由核心酶 完成；模板链起指导作用，合成的RNA与编码链内容相同(只是U代替了T) 链延伸方向53(与复制相同)。小小 结结2、转录的特点：选择性DNA分子只有一条链用作模板指导RNA合成，合成的RNA与模板链碱基互补，而与编码链的碱基内容和顺序相同；特定的时间只有一定的基因被转录；转录的选择性原理已成为基因反义技术的内容。3、原核细胞转录启动子

28、是DNA分子中起始位点1035区的一段特定的核苷酸序列，该序列能被RNA全酶识别、结合并启动转录。足迹法：利用DNA序列分析原理建立的一种DNA特定序列或基因检测技术。32P32PDNA一条链末端被放射性标记的溶液(如32P-DNA)加入RNA聚合酶不加入RNA聚合酶同种溶液分成两份限制性内切酶限制性内切酶保温、酶切变性、电泳保温、酶切变性、电泳当RNA聚合酶结合DNA后，限制性内切酶的一些切割位点被遮盖，切割次数减少，相比较溶液中缺少某些长度的DNA。酶作用结果酶作用结果酶作用结果酶作用结果PAGE放射自显影DNA迁移方向失去的区带，表明是RNA聚合酶结合DNA的位点加入RNA聚合酶不加入R

29、NA聚合酶加入RNA聚合酶不加入RNA聚合酶失去的区带，表明是RNA聚合酶结合DNA的位点失去的区带，表明是RNA聚合酶结合DNA的位点被结合蛋白保护的样品在电泳图缺少的谱带处留下空白，即所谓的“足迹”。用这种方法可了解RNA聚合酶结合的DNA顺序 对于一个特定的基因来说，编码链可以是给定染色体DNA双链中的任意一条。353535353535编码编码编码编码转录产物RNA 基因与DNA：原核细胞、病毒DNA中基因可重叠；生物体系基因转录具有不对称性：被打开的DNA转录时只是DNA分子中的一条链起模板作用；但另一条链也会反向编码另一种RNA，或从另一处启动正向编码一种RNA。重叠基因：两条链不同时期分别作模板