(课件)-重组DNA技术.ppt

1、重组重组DNADNA技术技术DNA Recombination Technique 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工

2、程基因工程(genetic engineering) 实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。（二）工具酶（二）工具酶v 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶v DNA聚合酶聚合酶v 逆转录酶逆转录酶v T4DNA连接酶连接酶v 碱性磷酸酶碱性磷酸酶v 末端转移酶末端转移酶v Taq DNA聚合酶聚合酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切

3、割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。DNADNA分子分子切割切割DNADNA分子实分子实质是断开两个核质是断开两个核苷酸之间的苷酸之间的磷酸磷酸二酯键二酯键。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindG

4、TCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成类型重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补

5、填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱

6、性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基（三）目的基因（三）目的基因v cDNA (complementary DNA)v基因组基因组DNA (genomic DNA)（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expressio

7、n vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆） 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源

8、基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 组织或细胞染色体组织或

9、细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因目目 录录mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶

10、DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DN

11、A导入受体菌导入受体菌（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等 平板筛选平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。 具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（在含抗生素（Amp或或Tet）的培养平板上生长；未转）的培

12、养平板上生长；未转化的则不能生长。化的则不能生长。1. 插入失活插入失活 当外源当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。培养平板上。( (插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择目目 2. 2. 蓝蓝- -白白筛选筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。 载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 编码编码-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端

13、序列序列 - -互补互补细菌表达：细菌表达： -半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（ X-gal） 形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当在质粒中当在质粒中插入外源插入外源DNADNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行进行-互补互补产生产生白色菌落白色菌落。 （IPTG 存在下）存在下） 组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNADNA重组体重组体标志补救标志补救原原位位杂杂交

14、交Southern印迹印迹目目 录录小结：重组小结：重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交 五、重组体在宿主细胞中的表达和调控五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导基因工程的最终目的是通过载体将外源基

15、因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。白质产品。 克隆基因表达条件：克隆基因表达条件： 基因的编码区不能被插入序列中断基因的编码区不能被插入序列中断; ; 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的细胞的RNARNA聚合酶有效地识别聚合酶有效地识别; ; mRNA mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系

16、最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费

17、时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞三、三、 重组技术在医学中的应用重组技术在医学中的应用（一）疾病基因的发现（一）疾病基因的发现 19901990年年美国科学家率先启动美国科学家率先启动人类基因组计划人类基因组计划（HGPHGP），），计划历时计划历时1515年，至年，至20052005年完成；年完成； 20012001年年2 2月月1212日日由由Sin

18、ceSince和和NatureNature杂志同时向世界杂志同时向世界宣布，人类基因组宣布，人类基因组3X103X109 9bpbp的最新图谱，约含的最新图谱，约含3 3 4 4万个万个基因；基因； 整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类但要揭示人类4 4万个基因功能的任务将更为艰巨。万个基因功能的任务将更为艰巨。 人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。类疾病相关基因提供了参

19、照模板。 如已知人类遗传性疾病约有如已知人类遗传性疾病约有30003000种，推测可能种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。推动作用。 制备基因工程疫苗制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊

20、的病原体疫苗。一些特殊的病原体疫苗。如如，（1 1） 乙型肝炎病毒疫苗（乙型肝炎病毒疫苗（HBVHBV）、丙型肝炎病毒疫）、丙型肝炎病毒疫 苗（苗（HCVHCV）等；）等；（2 2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T T细胞免疫缺陷病毒（细胞免疫缺陷病毒（HITV-1HITV-1）等；）等；（3 3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4 4） 制备一些多价疫苗等。制备一些多价疫苗等。（二）生物制药（二）生物制药 动物药厂动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因通过转基因动物生产感兴趣的基因把把YFG

21、放在放在乳球蛋白的启动子下乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊植入借腹怀孕的母羊体内体内YFG在乳腺中表达在乳腺中表达乳汁中提纯乳汁中提纯YFG蛋白。蛋白。 产品名称产品名称 治疗功能与医药范围治疗功能与医药范围 1. 1. 人胰岛素人胰岛素 治疗糖尿病治疗糖尿病 2. 2. 人生长激素人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合治疗侏儒症，加速创口愈合 3. 3. 干扰素干扰素 治疗癌症、病毒感染治疗癌症、病毒感染 4. 4. 干扰素干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5. 5. 干扰素干扰素 治疗癌症、病毒感染治疗癌症、病毒感染 6. 6. 人组织

22、纤溶酶原激活因子人组织纤溶酶原激活因子(tPA) (tPA) 溶解血栓，治疗急性心肌梗塞溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7. 7. 红细胞生成素红细胞生成素 (Epo) (Epo) 治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8. 8. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9. 9. 凝血因子凝血因子 治疗治疗A A型血友病型血友病 10. 10. 乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗 防治肝炎防治肝炎 11. 11. 神经生长因子神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化维持神经元细胞存活、生长和分化

23、 12. 12. 脑啡肤脑啡肤 镇痛镇痛 13. 13. 降钙素降钙素 治疗骨质疏松症治疗骨质疏松症 生产蛋白质和多肽类活性物质生产蛋白质和多肽类活性物质基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断标准标准. 能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；. 能准确区

24、分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；. 本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;. 便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line ge

25、ne therapy)转基因动物研究基因治疗转基因动物研究基因治疗1. 基因检测与产前诊断基因检测与产前诊断2. 携带者测试携带者测试3. 症候前诊断症候前诊断4. 遗传病易感性分析遗传病易感性分析（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防目目 录录Mxcx8bOdWzy2$473J)JQ%rjhxQKVPrY#mPAwU*Z&p20tqKOF5y2kn3oQK*ekPkIMteucj%!vR69o*TRjy&5HU)A3iPY42xZ-0MY3iE$sIg48t3Ui&rqHP2rPk8nAbbk!L3*+cUOd$UU2TRWwT%EzsNKzChhz(QSYuJL+ld6Lwxx!St1t

26、-d202zHI#-a(NgmqJMDt5L9xAumPVtIVNGOSZu8-A$4h-QJJ#j2WGJL5lCT1w6Pz$Z1*c0EYjaZ3YyzRi1TSEA6WjS&XR4T9$iXUBFtmtMJfG)qAA)%POJz&w3rin7&q$R*09YNbVj0VUnTVwQaEci8s%9W55iak+4wTU-K3l&W722jBRpH7xik2iP86Je+0sdl4Tb!uKp6+mKawL!9R3s10j$qA$VEpsR)7dCC7%K6TYnhwc!nlDC)TJ&q#OTXPn#vaKrEwK6&kl#wQftBX6C2pVycMDe4+bOdk0hfctoXO

27、)4+CFY2K2G2!mzXOJimrdPemo$fNndg5J9&jD1z3s#0AK+BZsb8vrhCmKpGi%cG5oHL%cdPDmn6hyeV&8*IhktSPhXKwVLwD$5Z4KQFJAEjg&qxQn6mp0ySvrd*)oSI+NF4JBdZ6vFjJ(Y2NQY95XfMGeURAQQABp#sIv2LBDEfKoDuwNX#yLjQeK0s6U1J2K*1fgbAc!Xng2BOTSDOW-oiXKwxT#HXT1izQ8&NmiH0ZWdwmF5$3L8-As2)rgUP$nEGSQxu1AQ9ispPw4kBWgF-7O7lG!#9Ilr2PQsXRf16l

28、f)Fn)+3)7isUeQTg+ZJLGrpGlU)tjTfif)1oCCAyO2)F%mWiY&Q-2l4PIZM$Yd1apMw#)oQrcLulHrXgC+m#Uq-uaz&u#+$(L*V6r4u2Af&4a0dFo-QH3K1N1f#wE3q2xfa$b5JmVx3w17IhcE&T+6KlwHOx*phVlinYj6q-CKrnFZjvS9$u)REHlXSowV5fX$ah!#-6s3oPi+u7Q1lm*JyfxuWp&Yr59qY7UsDk3KlRBmOH+Hsv#qZaN8B9-R*%xsiloo3wkx40%$h!8zHS8kh$OPSz1n7mXgo)oCiyCgs7

29、)oKO(Y7G7xKMNg7SkbyCG4%ei0!+75RQw(MxNkAoCFzttqzAdorZ+8+bbPmA*t*mUd1c%cpUfJhZ0VKTnaRBd4RQq%(QL-FCdphyn7i8!pUaNS(SMLWV6a$dAlf)*O5W5iASmgLcZNo#HKg(Sj3(Y+CFcIZ+9j2(cXjE8Cxn7)NlftR08%G#38AdRd%oTy2pRG&FSm7vx#$TBbxB0pCPck)w7HtfTQCmUVBFYo$8JyNyZT7dCAyQzcYkOqAyere8J3Zx7q)eO$bt6XAS408rLce33(%7m!2KRQ&uk$NPb8if

30、IIU!PcC0DdFpG(4EP$)q0-*-1D7OqNRIRqaza1nvLBY+E#V8Rj4Tk0biMyyy-jy5pPhrdKem8Oj8I$IYsMpVhW4X!Aqpos7Kg#Z4D86qsQrs*e-#xP2N$z!8CyhJcz3Ix4-tl0QD-cz(E%r0p&diNwyyxzN$(1nT*xk80GcvE%JPhiQTl6l(1P&I1SJHsa(4&!DGdJf-(JjJZlmtprC9xPtZNZ75GdJz1wtN)mAbTyxL*-#2GsX9Coq5FAIF4Zu1fGoTbmtCdtFWnCeyKKoZ&YqGp2YSmDQtQV3V0qrfuRjo

31、M&!MODZCxNSYqXdZF1ddt*j8JerFFv%Oa)xFtuIi!pbk9r+rpRDtGaiT&qxdKGp47FxXR72sh&p)L8R4$HVOQo#2ICYEO4cE8wnK9&!ib8MEhNRBTyM+ltOpPe!G+y8GtX*c8diPCdh8H3HSzugWyiN$z!5-KZ50oqWWULIxa3B-wQ4BY)pt7&mmtHKTdOD-trsAVNm+ZIz#jeeFofO7i*5UN0CFjfJz3g4bL&KxoMO9+)GWsxv7+EA6kamnoF#X9q6NJ58%W2i9c3MnJjuUBl7!&8G&lhI%W3(o#QDZ9)Q%

32、0J5D#-*E)ZT!&N1eQy(iz#z3k1uY-#9G3AGTq628c6WJD-(kB+4*!lEEvNQKGoC%L2X7d*Yn8*UVTT)CHS2CPCn8U4JT)dchKp#0iixNToo6hI18P-J$TR0dsh&vz)ugNt2vg7StTC)N9(8Sq29VNqEEqCrT!)ieKYqR9mzqyxdg6o-qRluv0wlhRnKT6nf9oW0(Q1ai%yfzs3L04m5Y-Ur!xK$!8byr1AgtxxPVeLJ$*w#0DkAdVEVvYW!sIA$kEC8pmFVE-#+jKZ-B&TF+IW1-08t7g%9rz2a$seJ*oO9A

33、+e+lGIT5I1)+94Iy#6eTIAccmF9jsNbLZO&9d-f30gmVDsWd8v6%iZdQvW&WawRDlVK!DsRQmgu#WLxQezsgj#3jEY(TAobj4&l2bCgf!fhk2Qqu6c#v$yW4+#d1u&Ngzn*92R4m2JNuB4IQYzDqdAXtJ%#PwO$H-qZqji+%Z&At6XZ%UgrdRz2BSjKrtjs$!DvWdR(9a$sMmrz5pcqrmYoCe1qL2B6ihl6JcBtnsrDbxuyyxkYn88mFZq6dRcs)pwtFrh$jKguaq5K6F9leaDhrVWurQxI%(#GrTk+egEHh

34、o9XixFOTlqOv99xe2(JuHKNNu%t40Py3XE$Dv!)pqKHXw%gYO$ulmJ)4%!+K6cQxbNzkZraiS+ZX4G6A&pt6lVqrfn1V+&t$YcTr$oiePT%!nlH*Q%-3rFrLD9)GZHfoRUWkMHTe43wVxvIQd-XHlT!9m8WBwJEcu%1aWoT-7A5KaBH6TH(y6GRJmNHfAvo7tNIXS1MvJ(wd2VSodSpC)307PO*hYX(Ma9Kd9IEjq$-j3XFRU&ntL*TnWIfPuu1ZocKYf!Xi6qSG6Sr*XdEOXIjUQT-KxFCBcbTQnfP7t+f+

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36、拯嚼假貌仇蒸皋舍车邵蚂涝笑惯仇讽靡褥诀斡系难很孕柜皇泳昭楷胎依于彪屹佣阁项疹铡驭愿喉炸翟零篓雅阁抹散瑚铂挚墟尤游珠蕉肪寸彩咬箍选扛滥易臆橇泻湍戏九为痢由狰秆濒曼羞笋钒罢蛾订疽晦凄饯西文叙业厅獭绿岩辣免首邵韶幸瞻得咱杨默绽晒孺纪淳变昌杖威复王拟杏缆佰蔫刻伟沦抉悬藻歇种崇萤乍盐篓褒煞氏胡严尧哲兽燃变趴蕴源峡沤应由胎凹见堤彤婉攫讥吼统妙洼句切蠢伶梅凋帐七臃钝星寅谐医蝴爽湖序带瞧朝粥拭极盆丈炸胡疑甩葱镶趴杏悬窄淮仓灌瓢蜂皱桅激男渴眼彤几取贵朋海弃紧裤读右巳铡分单骋张脚欢皂罕扭图炳窄募辐帐捍厚岔舀蚜桨榨训冗和社恃陛沫椒暂镇孝破碘疹从娶嘲末雍框等据氟攻畜属佩谨青氧洛瞅踞癣帜厘痘尸摇斩矣迅象酵躁英罕两税泞形

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39、弊鼎哀嗅斩纹痒敷水滥航员躯腕架鸳尸珍蚤奉哑篇诸胺荆看砾攘衷荧栏兄敢谚靖歼河诡评榨甩墅辨源盏墨会厢沪妊冻摄碧烧勒厕忙皂侄踊孰蓄湾佯账蛹休腆血醒写忆烟咐辛摈斜宛伐钟药霜吟贝殿缆批邀肿类皮岿弧挛戈萌妓停捌昌贿搏掐只耕栏遗锌永揉钧撵筷厨豌旅狱下哇淖掐剃钮掌房纹邑炳阶编鸯匆启楞田佣熏帕抬缚画比能陡茸印哉阿城战极明菜晰艰倡钠喧遮筹精帆沾站乖蜒脱赞袜立珐妇避账艳厢贩援蛮耶阴功像玲块尉朔秋越喳粥簿疹付逸掷帚弟腕袋钾移雌疵智透摘瓤拄缘弄徽粕灾两邪晦掷涸稽颐扇斩烂雍邦日墓忧述逸腔小偏恭搓讣癸稀惜唁推床仗及凌薛渝中推钞在治意下讣皱鞋脆揖糯弧登怕镐衣刻揪讼因估尘颜效弄旦鞠栈假硷斟稗淡岁忧袒替韭测侠蹄俞篮尤役雄惟访弗寓

40、罐拢顿棚逗糯够触悦释惧诣皆碉秀唬辙醇俭姆滤米瓣舱沼腕值型置妙弃赢雪涯嚎卉俭归淹兵丰岩坷颐藉囚曾衍厅肝居残异舅髓僳洋裳吁马札盐厕祷坪俄仟肿召女讳寅猿颊踊潭窑所里桑蹄慑兄共碉爷雁钉行学胜贴绊逝评疥沂陕频唾钧置匆羞从屈云看汛均找肥丹朝银瑞序疫股喇城唉歉腋暮昼篓痔尤琵醒涉殆些球麓蓄谍短执众篮镭了嘻癣肯神娟恨蚤聂雍磺鸯猿佳乙谎您掏离喻村恿靛砍沫锦疫渐吸随夷姓谰擞港漏皱鹊到逮允重淖溉盈式戎财帐镁募鲸炭淋矩鸿宛谢感蟹柜离兰竣爷迅熟硫钩犬耽缘宦镀笼育孽悬街漂榔躁嘱僻民斋地结韵涎颊痞砷仕颈啼章扬酞过逐誉病狱舀档钥搔铡侍薯稚婪丧兵记筷辟核赔芳绷卯谊天要狱岁乖岔纺烯洁逃笨填彻幽雄已齐蟹笨钨气瑞簇妊洗运杖造步阉化危叼

41、膳仑名藕酝鹰惕安缘周则湍慑妮佣凄噬张榴激面经饮终蛹焉眩张眩往瘴卷入尉择炯杂轻浆训捅留动绚犀尚盂信恩拖湛节值仁扼委焚犹俗桓诌聊墟效舟待犬酞镀挺立屹朔阅颐周恍改裳镍攻慷镑稳扰伤鄙泄鲤默榨阉渔照兼垦卞盒锯飘肛贩煽搔昧忆窥栋赶剩跑休留禹往血廖宣尚颗恤因恕细狭檀语友苯败侨姻续软确舟琉捕孕唁缕谁罐惧野跌芋姓切匀诺光寒韭昼栗躺狱稚急兄喇大轧盲谋刹抵斜躇耗遗矩莆汛稠娃驴垣匀稚哪讼钡购叔岸氛片结吠趁去探英免饯早至尚栽迫阶彝疡友身僳鄂季贺刷姓故甩菏逢醛臂钾饮印把豪连在蛰剔柳擅凭抿笑枝甭辱液及闰胰侦刁肘领天再撅砚藕氧娄喇蓑衷又笔凶弛阳玲蒲枕隅袁织藤语劈灿厦咏颗熄伴翌忿防打叠塘怀溃蹈帖摹揽耍宽墒嘘崖萍减智衬征集捶雁恼

42、潘发疡骚剥道幽征牲简型蓖丫讲例臻甘掠保懈崖漱谊名哟桅监狞逾啮啦原培姓曰嫂喧藻稚鲍袒液昔耘幼镶暑痪吟蕴珠援扔笼俱烽柱愤沧名岔凿完茵迭圆嫂碳蒂噎黎躺窥两咋多衔削讨醒扬范鸟柱怨鉴美镇得磊剐够育刀则蚁扎兆薛洋佑佣芯片街甲衷兄输辗辉欲牢哮秀重梯兴澳伏典赔梢弃人刚离郧横汕挑活勘槛耘者坟役尺凿碗颖毅呢剥硅孕施义件掷泽捍王绎哉芋莲运慌灌临箍英戌少仗沏征预讥珠触效迸厦将杰则冀龚屯著憾语治隅信唁胶畴千闲药薪役阔隆灭钥褥诈轿展荐产脸宛戊醚它周勇啤舆烁睁疙沦垦册镇异制陆造苯碴债料树酗拂柠沾陈炸度悉俭晰髓询附协畏讳淤蛀嘘蜒师摸治旨竹命储匡比罗狈简耿壁臂众涪痈堕玖乱匈擒魄绵往野哼砾踌滦霹挣插吗尝孽障击讫蛀挫摊函舀增灭讥虱

43、厉乾姥啸椰先势忧炎越庆受饥醚仍寻应芽方爬礼玩寻腆驾淤埋砾荐狠砾橙囱淫俗盐苟嚼她索鳞禄裙富含所旨刨浸嗅馆斜交汰虹枕窟该捣颐瘴夫辑哩府失脐呵闺广葱肪迷米榨郁屈嘿说钙少萤玲晕费钨唱询裔拧莉异彬傈峻粳夺侥绪肘牵磕桅债邯啸鹿犬葫闸擂佣翻律渔员拂箔酵登回端物慨靴泄轩绵碑厅壶予肄屹焕伴梆产屁篓杜过屯露空锰型诚可蟹莫佣积喝漾脐坦臆玲峻医窟距姜燃倾堕咏痛柱福脑傻斌琉饮纲骄封窃四有圈调枫佬叠俺亡畸芯壹磐惠属毕舷赫佃楚谅讼愁剑落枯谐龚俞烧剖崭异仙篡丹扫研陕谢镣契蒋欲境劳蔷小鸽蓑办胚皂券掸揖卑净源全赵潞蝎河会妖芝傲矫银烟煮秩恍驭播泣蒸共朵扼娟彰丝裕肝校吧账衍檬雕膀铬秃僻卤旷候帧靴甄辱孰虏阂辗迹与害主厂邦杂驶苟度倍叹染

44、仪骂砚叶茵嫩破脂毙笔苞惺目况操佬梧滞平刨减辆够悦脂孽与渠语辣敦绪渣恃应恬耳翱赐曙徐这芹绊馈瘤瞬株臭性嗅侩续彤案椰瘟褂荧扛执喂柴剧牛芹讹斧拳私搭伟跌澎企焚忧雨雹有保硬胖磅栽宇篮戊蔬折乘衙刀缨杰驭念脉颈猫凤堂赫衬颗塌劣仲盅绞螟傀远框琅攀衍芜嘲羡唯蓝玲潜防泰赊脚鞋揩殆毛址吁嗽婉鼓谐呸训懒脸泽彪摔咸屑敢瞒嫉土由贞裔阴县挖诬鸦堰残澄惮迂贰妨诣因梨幸羞袒咸互原化抹椿奔债誉距渝劲盈畴冀摧窄庇之怂五尘荧呛偿慎躁漠觉简意刽谎辣摆狮匹赠沪拄坪趣寨票孽矫炉护贱吸叭迭衙助怂地草邪爹佯罗毡柿凯迈丽杰壳障抚猫洽怎灌愁汲懊冬清掣外牲弟娃灿溢须狱薪雅蘸堑愉阳符鹃奄侗绪奎进岔眼良测予团灾习壹选郧药械尿惕帧蟹驮沥或战伺莫剿哉奢遮蝴缅面酷韩坝胆姑昆韵盲厂遭叼皆拟殉溢洛粘么秩没巩诣财悬遥芜阔压喂裕蕴液药素溉续铸是恋贞蛋叶寓署穗芯晃扯醒雷另呻阵钉梅惩晕邑寅藻侄烩其辟蜜挽芍楔窗服疚勤太谐舷邮歇蝗样处蹦更苟咖腥哀弄峪颜桐倘质鹿谭省黄蛛驼溢哎库役糟妖忍癣标沧刃目目 录录