ppt课件-dna重组技术.ppt

1、第六章 重组DNA技术的操作A DNA的体外重组（切、接）B 用于基因转移的受体菌或细胞C 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） D 转化子的筛选和鉴定（检）第六章第六章 重组DNA技术的操作过程切接转增检一 DNA的体外重组（切与接）第六章第六章 重组DNA技术的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换人工粘性末端的连接重组率n外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用。n一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素： (1) 实验步骤要尽可能

2、地简单易行， (2) 连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段， (3) 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。 F重组率重组率的定义 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。F重组率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTC

3、G5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶二 用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件 一、宿主的选择n 从安全性考试，应具备以下条件： 1. 不适合在人体内生存 2. 不适合在非培养条件下生存 3. 在非培养条件下，其DNA容易解体 4. 它的DNA不易转移 5. 它的质粒只在这一宿主由复制 6. 便于检测 A 受体细胞应具备的条件从遗传性考虑： 1.重组缺陷型recA，用于基因扩增或

4、高效表达的受体细胞（recA-） 2.限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源DNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 3.与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型） 4. 具有较高的转化效率 A 受体细胞应具备的条件B 各种基因工程受体的特性大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌 产物结构复杂、种类繁多的内毒素B 各种基因工程受体的特性枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速

5、，培养简单，不产内毒素 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备B 各种基因工程受体的特性链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢B 各种基因工程受体的特性酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高B 各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕） 具有真核生物

6、的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达 DNA重组操作系统欠完善B 各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 B 各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良 遗传操作繁琐

7、 C 实验室常用的基因工程受体大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms） 用于接受l-DNA：LE392、ED8654 酵母菌哺乳动物细胞 CHO 毕赤酵母啤酒酵母三 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增A 转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 A转化的原理与技术Ca2+诱导

8、的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的制备：100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用 收集菌体A转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组冰浴放置半小时 在42保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 DNA连接液，混匀加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进

9、行筛选 A转化的原理与技术细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化 A转化的原理与技术细菌原生质体的转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂 细菌原生质体的制备：A转化的原理与技术细菌原生质体的转化 取0.2

10、- 1ml的原生质体悬浮液（108 8-109 9个原生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的转化：细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素 A转化的原理与技术l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600 = 0.5吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增

11、加，然后涂板筛选A转化的原理与技术电穿孔转化 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验B 转化率转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，

12、即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）B 转化率转化率的定义 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA B 转化率转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组

13、率为20%，转化率为107/mg载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104 4个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10 1的要求算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选 B 转化率转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，

14、其转化率不同 载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 B 转化率转化率的影响因素受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 B 转化率转化率的影响因素转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法：Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA 原生质体转化

15、109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA C 转化细胞的扩增扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作 C 转化细胞的扩增扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定 四 转化子的

16、筛选和鉴定（检）载体遗传标记检测克隆DNA序列检测外源基因产物检测四 转化子的筛选和鉴定（检） 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子转化子重组子目的重组子A载体遗传标记检测抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr抗药性筛选法的基本原理： pBR3224363 bpori抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子

17、呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs A 载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为 ApAp + Tc影印挑选重组子 A载体遗传标记检测营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上

18、，长出的便是转化子 A载体遗传标记检测营养缺陷型筛选法常见的营养缺陷型筛选标记： 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径： 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型dCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTKAP 氨基喋呤TK 胸腺嘧啶核苷激酶n胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidine Kinase,TK）在所有在所有真核细胞中都有表达真核细胞中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键是嘧啶生物合成补救代谢途径中的

19、一个关键酶酶, 它可催化胸苷磷酸化转变成为它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成继续磷酸化生成dTTP, 参参与与DNA的生物合成。的生物合成。含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补. TK-细胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+细胞可存活，以此进行筛选.A载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细

20、胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等A载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法的基本操作： pUC18AprlacZoriAp + X-gal重组子（Apr + lacZ-） 将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落 B克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重

21、组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。B克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分重组子与非重组子用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段重组子： 2.7 kb + 4.0 kb非重组子： 2.7 kb如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子B克隆DNA序列检测 限制性

22、酶切图谱法全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriSSBP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分重组子与非重组子如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1 / 50 B克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI Sma

23、I KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kb用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kbB克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBE4.0 kb2.0 kb2.0 kb区分目的重组子与非目的重组子对

24、图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0 kb和2.7 kb两条带子，实际上2.0 kb的条带中含有两种不同的分子2.7 kb2.0 kbEB克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法部分酶解图谱法：2.2 kbPstI EcoRI BamHIBBE4.4 kb1.2 1.8 kbEB0.6 0.8 该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：BamHI全酶解：0.6 0.8 5.2 kbBamHI+EcoRI全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb其中，1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端BamHI部分酶解：1.4 2.6 4.0 kb其中，1.4 kb的片段

25、必为0.6 kb和0.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；同理，2.6 kb的片段必为0.8 kb和1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后，4.0 kb的片段必为0.6 kb和3.4 kb两片段，表明两者是连在一起的B克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据 B克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落原位杂交法的基本操作：影印用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 洗涤杂交感光用0.4N的NaOH溶液浸泡

26、影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用X光胶片覆盖薄膜感光 B克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链DNA可用碱变性） 足够长度（至少12个碱基） 内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括：人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGC AB克隆DNA序列检测DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本原理： DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重

27、要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有：DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 bp / 601 bp）电脑自动检测、记录、编辑程序用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit） 在模板指导下，聚合酶不断将在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的加到引物的3-OH末端，使引物延长末端，使引物延长，合成出新的互补的合成出新的互补的DNA链，如果链，如果加入双脱氧三磷酸核苷加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的由于双脱氧核糖的

28、3位置位置上缺少一个羟基，故不能同后续的上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同即形成一种全部具有相同5-引物端和以引物端和以ddNMP残基为残基为3端端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取从而读取DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。双脱氧终止法测序反应体系包括双脱氧终止法测序反应体系包括：DNA聚合酶聚合酶单链单链DNA模板模板带有带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种种

29、dNTP(aATP,dGTP,dCTP和和dTTP)4种种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和和ddTTP) )Sanger法法DNA测序的试剂测序的试剂 引物：通常由引物：通常由20-23个碱基构成，个碱基构成，G+C=12，A+T=8到到11，Tm=60-68，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 模板模板 DNA聚合酶聚合酶 2，3 -双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸（ 2, 3 -dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） dNTPB克隆DNA序列检测DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本操作： A C

30、 G T ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA Primer Primer Primer Primer KlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA G T C DNA聚合反应聚丙烯酰胺凝胶电泳C外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法淀粉酶目的基因的鉴定： 淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。

31、如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，易于辨认。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定C外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定： 抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子 在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生C外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定： 目的重组子 诱导

32、抗性 抽取重组质粒再次转化C外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法DNA结合蛋白编码基因的鉴定： 影印用聚乙烯薄膜影印裂解平板 洗涤杂交感光轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 80烘干固定影印薄膜 与探针溶液中杂交 洗涤、干燥、感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板 聚乙烯膜探针选用能与 目标蛋白特异 性结合的DNA 片段 该方法用于该方法用于cDNA文库中目的基因的筛选。其原理是在体外无文库中目的基因的筛选。其原理是在体外无细胞的转译中利用细胞的转译中利用cDNA与与mRNA杂交后导致杂交后导致mRNA的不能翻译，的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。从而筛选阳性克隆子。 分离的基因编码着丰富的分离的基因

33、编码着丰富的mRNA。 优点优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。 缺点：缺点：较烦琐。较烦琐。 C外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法步骤：步骤： 1. 将从大肠杆菌菌落或噬菌体将从大肠杆菌菌落或噬菌体群体群体中制备的带有目的基因中制备的带有目的基因 的重组质的重组质粒粒DNA变性后，与总变性后，与总mRNA杂交；杂交； 2. 转入无细胞转译体系（麦胚提取物或兔网织红细胞提取物）转入无细胞转译体系（麦胚提取物或兔网织红细胞提取物）,由于由于加有加有35S标记的蛋氨酸，转译的多肽蛋白质可以通过聚丙烯酰胺凝标记的蛋氨酸，转译的多肽蛋白质可以通过聚

34、丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析；胶电泳和放射自显影进行分析； 3. 结果同未杂交的结果同未杂交的mRNA转译产物作比较，从中找出其转译合成被转译产物作比较，从中找出其转译合成被抑制的抑制的mRNA，即同目的基因变性即同目的基因变性DNA互补彼此杂交的互补彼此杂交的mRNA。C外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法C外源基因产物检测蛋白质生物结构鉴定法放射免疫原位杂交鉴定： 影印用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印洗涤与I125标记的IgG保温感光轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 与I125标记的IgG保温洗涤、干燥、感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板 含抗体的聚乙烯膜 裂解平板 C外源基因产物检测蛋白质生物结构鉴定法免疫沉淀鉴定： 在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体 然后涂布转化液 37 培养 经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标 蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀 反应，在菌落周围形成白色的圆斑 此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大 C外源基因产物检测聚丙烯酰胺凝胶电泳法如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选