2013中图版选修1第六章第2节《DNA片段的扩增-PCR技术》ppt课件.ppt

1、第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术第第2节节DNA片段的扩增片段的扩增PCR技术技术第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术学习导航学习导航1.理解理解PCR扩增扩增DNA片段的原理。片段的原理。重点重点2.尝试尝试PCR技术的基本操作和应用。技术的基本操作和应用。 难点难点第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术新知初探思维启动新知初探思维启动一、一、DNA在细胞内的复制在细胞内的复制1.所需的酶：所需的酶：_酶、酶、DNA聚合酶聚合酶和和RNA聚合酶等。聚合酶等。2.引物：引物：_。3.原料：原料：_。4.原则：原则：_。DNA解旋解旋一段一段RNA四种脱氧核苷酸四种脱氧

2、核苷酸碱基互补配对原则碱基互补配对原则第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术二、二、PCR及其过程及其过程1.概念：概念：PCR即聚合酶链式反应，实际上是即聚合酶链式反应，实际上是在在_模拟细胞内的模拟细胞内的_，形成大量形成大量_的的DNA片段。片段。体外体外DNA复制过程复制过程特异性特异性第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术2.过程过程条件条件过程过程加加样样室温室温把把PCR缓冲液、缓冲液、_、一对引物、四种脱氧核苷酸、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、聚合酶、Mg2等成分加等成分加入到微量离心管中入到微量离心管中DNA模板模板第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技

3、术技术氢键氢键一对引物一对引物DNA聚合聚合脱氧核苷酸脱氧核苷酸第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术判一判判一判(1)细胞内细胞内DNA复制和复制和PCR技术所需的引物技术所需的引物一样，都是一样，都是RNA。()(2)经经PCR技术合成的技术合成的DNA分子中，每条单分子中，每条单链都含有引物。链都含有引物。()(3)PCR实验的原理和操作都十分复杂，不易实验的原理和操作都十分复杂，不易于操作。于操作。()(4)经过高温变性、低温复性和中温延伸三步经过高温变性、低温复性和中温延伸三步操作，操作，DNA片段可呈指数增长。片段可呈指数增长。()第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术

4、三、实验操作三、实验操作1.准备准备(1)为了避免为了避免_等因素的污染，等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸头、缓冲实验中使用的微量离心管、吸头、缓冲液 以 及 蒸 馏 水 等 在 使 用 前 必 须 进 行液 以 及 蒸 馏 水 等 在 使 用 前 必 须 进 行_。(2)如果没有如果没有PCR仪，可以设置仪，可以设置3个恒温水浴个恒温水浴锅，温度分别为锅，温度分别为_、_和和_，然后按要求在然后按要求在3个水浴锅中来回转移个水浴锅中来回转移PCR的的微量离心管即可。微量离心管即可。外源外源DNA高压灭菌高压灭菌95 55 72 第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术PCR

5、热循环热循环260 nm第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术想一想想一想决定决定PCR反应特异性的原因有哪些？反应特异性的原因有哪些？【提示提示】待扩增待扩增DNA片段的特异性。片段的特异性。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术要点突破讲练互动要点突破讲练互动要点一要点一PCR技术与体内技术与体内DNA复制的比较复制的比较细胞内复制细胞内复制PCR反应反应解旋解旋在解旋酶作用下在解旋酶作用下,细胞提供能量，细胞提供能量，部分解开部分解开加热至加热至90 以上时，双链以上时，双链全部解开全部解开酶酶DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶引物引物

6、一小段一小段RNA单链单链DNA第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术细胞内复制细胞内复制PCR反应反应能量能量ATP不加不加循环次数循环次数生物自身控制生物自身控制30多次多次子链合成子链合成一条链连续合成一条链连续合成,另一条链不连续另一条链不连续合成合成两条子链为连续两条子链为连续合成合成,温度为温度为72 产物产物完整完整DNADNA片段片段相同点相同点需提供需提供DNA复制的模板复制的模板四种脱氧核苷酸为原料四种脱氧核苷酸为原料碱基互补配对原则碱基互补配对原则子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从5端到端到3端端第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术特别提醒特别提醒PC

7、R反应需要可变的温度，而反应需要可变的温度，而体内体内DNA复制需要稳定的温度。复制需要稳定的温度。DNA解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键两条链的氢键断开；断开；DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸加到已有的单链片段的酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板端上，需要模板; DNA连接酶连接的是两条连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，片段的缺口，不需要模板。不需要模板。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术 PCR过程与细胞内的过程与细胞内的DNA复制过程复制过程相比，主要有两点不同，它们是相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是

8、人工合成的单链过程需要的引物是人工合成的单链DNAPCR过程不需要过程不需要DNA聚合酶聚合酶PCR过程中过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，过程中，DNA不需要解旋，直接以双不需要解旋，直接以双链链DNA为模板进行复制为模板进行复制例例1第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术A BC D【解析解析】PCR过程与细胞内的过程与细胞内的DNA复制过复制过程相比较，主要有两点不同：程相比较，主要有两点不同：PCR过程需过程需要的引物是人工合成的单链要的引物是人工合成的单链DNA，长度通常，长度通常为

9、为1540个核苷酸。个核苷酸。PCR过程中，过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。控制来实现的。【答案答案】C第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术变式训练变式训练(2012成都七中高二检测成都七中高二检测)下列关于下列关于DNA复制复制和和PCR的描述中，正确的是的描述中，正确的是()ADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，只，只能从能从5端延伸端延伸DNA链链BDNA复制不需要引物复制不需要引物C引物与引物与DNA母链通过碱基互补配对进行母链通过碱基互补配对进行结合结合DPCR扩增的对象是氨基酸序列

10、扩增的对象是氨基酸序列第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术解析：选解析：选C。由于。由于DNA聚合酶不能从头开始聚合酶不能从头开始合成合成DNA，只能从，只能从3端延伸端延伸DNA链，故链，故DNA复制需要引物，而且它与复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基母链通过碱基互补配对结合。互补配对结合。PCR扩增的对象是扩增的对象是DNA，而，而不是氨基酸。不是氨基酸。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术2.PCR扩增过程扩增过程变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性95 ，5 min55 ，1 min72 ，1 min重复重复30次次95

11、 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一最后一次循环次循环72 ，1 min第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术图示：图示：第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术3.DNA扩增数目的理论计算扩增数目的理论计算理论上理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一条扩增呈指数增长。若只有一条DNA模板，则复制模板，则复制n次后有次后有2n条；若一开始条；若一开始有有m条条DNA模板，则复制模板，则复制n次后有次后有m2n条；条；实际操作过程中，由于无关变量的影响，一实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说实验值要略小于理论值。般来说实验值要略小于理论值。第六章第六章 蛋白质和蛋

12、白质和DNA技术技术 近近20年来，年来，PCR技术技术(多聚酶链式多聚酶链式反应反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试半保留复制，在试管中进行管中进行DNA的人工复制的人工复制(如图如图)，在短时间，在短时间内内,将将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。生物体。例例2第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术(1)加热使加热使DNA双链间的双链间的_键完全键完全打开，称为打开，称为_；

13、而在细胞中是在；而在细胞中是在_酶的作用下进行的。酶的作用下进行的。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术(2)如果只需要大量克隆模板如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个中间的某个特定区段，应该加入特定区段，应该加入_种特定的种特定的引物。当温度降低至引物。当温度降低至55 C时，引物与两条时，引物与两条“舒展舒展”的模板的特定位置结合，在的模板的特定位置结合，在DNA聚聚合酶的作用下，只能在引物的合酶的作用下，只能在引物的_端连端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是_。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术(3)PCR技术的必需条件，除了模

14、板、原料、技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的适宜的_和和_，前者由，前者由_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 自 动 调 控 ， 后 者 则 靠自 动 调 控 ， 后 者 则 靠_来维持。来维持。(4)通过通过PCR技术使技术使DNA分子大量复制，如果分子大量复制，如果将一个用将一个用15N标记的标记的DNA分子放入试管中，以分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则之后，则15N标记的标记的DNA分子占全部分子占全部DNA分分子总数的比例是子总数的

15、比例是_。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术【解析解析】(1)PCR技术利用热变性原理使技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤分为三个基本反应步骤:变性变性(95 )、复性复性(55 )、延伸、延伸(72 )，其特异性依赖于，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决序列互补的片段，两引物之间的距

16、离决定扩增片段的长度。定扩增片段的长度。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术由于由于DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，只，只能从引物的能从引物的3端延伸端延伸DNA链，则链，则DNA的合成的合成方向总是从子链的方向总是从子链的5端向端向3端延伸。端延伸。(3)PCR技术与细胞内的技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境环境(稳定的缓冲液稳定的缓冲液)，每一个步骤需要适宜的，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。温度和酸碱度等。(4)一个一个DNA分子连续复制分子连续

17、复制四次之后，形成四次之后，形成16个个DNA分子，分子，15N标记的标记的DNA分子有分子有2个，则个，则15N标记的标记的DNA分子占全分子占全部部DNA分子总数的比例为分子总数的比例为1/8。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术【答案答案】(1)氢变性解旋氢变性解旋(2)两两3从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸(3)温度酸碱度温度酸碱度PCR仪缓冲液仪缓冲液(4)1/8第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术互动探究互动探究(1)PCR中由碱基错配而引起哪种变异？中由碱基错配而引起哪种变异？(2)假设对一个假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时进行扩增，第一次循环时某一

18、条模板链上发生碱基错配，则扩增若干某一条模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所用次后检测所用DNA的扩增片段，与原的扩增片段，与原DNA相相应片段相同的占多少？应片段相同的占多少？【提示提示】(1)基因突变。基因突变。(2)50%。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术【误区警示误区警示】关于关于DNA的扩增方向容易发的扩增方向容易发生混淆，为了明确表示生混淆，为了明确表示DNA的方向，通常将的方向，通常将DNA的羟基的羟基(OH)末端称为末端称为3端，磷酸基团端，磷酸基团的末端称为的末端称为5端，子链从引物端，子链从引物3端开始延伸，端开始延伸，而子链的合成方向是从而子链的合成方向

19、是从5端向端向3端延伸。端延伸。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术要点三实验操作与结果分析要点三实验操作与结果分析1.检测检测PCR扩增效果的过程扩增效果的过程第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术2.结果分析结果分析DNA片段的扩增是否成功的判断片段的扩增是否成功的判断(1)对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。扩增的效果。(2)扩增不成功的可能原因有：扩增不成功的可能原因有：漏加了漏加了PCR的反应成分；的反应成分；各反应成分的用量不当；各反应成分的用量不

20、当；PCR程序设置不当等。程序设置不当等。第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术 在在PCR扩增扩增DNA的实验中，预计一的实验中，预计一分子分子DNA经过经过30次循环后，应该得到次循环后，应该得到230个个DNA分子，但是结果只有约分子，但是结果只有约210个个DNA分子，分子，那么不是出现该现象的原因是那么不是出现该现象的原因是()ATaq DNA聚合酶的活力不够，或活性受聚合酶的活力不够，或活性受到抑制到抑制B系统设计欠妥系统设计欠妥C循环次数不够循环次数不够D复性时，部分亲链与亲链结合复性时，部分亲链与亲链结合例例3第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术【解析解析】如果如

21、果Taq DNA聚合酶活力不够，聚合酶活力不够，或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得到的产物比预期的少。如果到的产物比预期的少。如果PCR系统设置不系统设置不妥，达不到预期的结果。复性时，模板链既妥，达不到预期的结果。复性时，模板链既可以和引物结合，互补的模板链也可相互结可以和引物结合，互补的模板链也可相互结合，从而导致产物减少。合，从而导致产物减少。【答案答案】C第六章第六章 蛋白质和蛋白质和DNA技术技术变式训练变式训练DNA在在_nm的紫外线波段存在一强烈的的紫外线波段存在一强烈的吸收峰，其峰值的大小与吸收峰，其峰值的大小与DNA含量有关含量有关()A220 B240C260 D280解析：选解析：选C。DNA在在260 nm的紫外线波段存的紫外线波段存在一强烈的吸收峰，其峰值的大小与在一强烈的吸收峰，其峰值的大小与DNA含含量有关。据此，可以进行量有关。据此，可以进行DNA含量的测定。含量的测定。