基因重组与基因工程技术课件.ppt
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1、基因重组与基因工程技术课件 基因工程亦称遗传工程,即利用基因工程亦称遗传工程,即利用DNADNA重组重组技术的方法,把技术的方法,把DNADNA作为组件,在细胞外将一作为组件,在细胞外将一种外源种外源DNADNA(目的基因)和载体(目的基因)和载体DNADNA重新组合连重新组合连接(重组),最后将重组体转入接(重组),最后将重组体转入宿主宿主细胞,使细胞,使外源基因外源基因DNADNA在宿主细胞中,随细胞的繁殖而在宿主细胞中,随细胞的繁殖而增殖(增殖(cloningcloning,克隆),或最后得到表达,克隆),或最后得到表达,最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传最终获得基因表达产物或改变
2、生物原有的遗传性状。性状。技术的诞生。伯格因此获得了技术的诞生。伯格因此获得了。 科恩随后以科恩随后以DNADNA重组技术发明人的身份向美重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了,人类可以根据自己形成的天然屏障被打破了,人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性,甚至创造的意愿定向地改造生物的遗传特性,甚至创造新的生命类型。新的生命类型。 19771977年,吉尔伯特(年,吉尔伯特(W WGilbertGilbert)分别将编
3、)分别将编码胰岛素和干扰素的码胰岛素和干扰素的DNADNA经过体外重新拼接后,经过体外重新拼接后,导入大肠杆菌中,分别使大肠杆菌合成了胰岛导入大肠杆菌中,分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。素和干扰素。 DNA重组的基本模式重组的基本模式总体技术路线总体技术路线从基因所在生物直接取得从基因所在生物直接取得化学合成法化学合成法人工合成:人工合成:根据已知多肽链的氨基酸顺序,利用遗传密码根据已知多肽链的氨基酸顺序,利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段(60-80bp60-
4、80bp) 多肽链的氨基酸顺序多肽链的氨基酸顺序mRNA的碱基排列顺序的碱基排列顺序相应的基因结构相应的基因结构化学合成目的基因化学合成目的基因化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。基因。化学合成的不足之处在于:化学合成的不足之处在于: -要已知基因的核苷酸顺序;要已知基因的核苷酸顺序; -基因不能太大,这一方面是测定核苷酸(或氨基基因不能太大,这一方面是测定核苷酸(或氨基酸)顺序比较困难,另一方面是因为每次仅能合成酸)顺序比较困难,另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段,短片段越多,要连接成正确的几百的短片段,短片段越多,要连接成正确的
5、基因顺序就越困难,得率越低;基因顺序就越困难,得率越低; -价格昂贵。价格昂贵。用途:用途: PCRPCR引物引物, ,测序引物测序引物, ,定点突变定点突变, ,核酸杂交探针核酸杂交探针从基因文库中筛选从基因文库中筛选将某一种基因将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后,与用适当的限制酶切断后,与载体载体DNA重组,再全部转化宿主细胞,得到含重组,再全部转化宿主细胞,得到含全部基因组全部基因组DNA的种群,称为的种群,称为G文库文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成通过逆转合成cDNA,然后转化宿主细胞,得到含全部表达基因的种然后转
6、化宿主细胞,得到含全部表达基因的种群,称为群,称为C-文库文库(cDNA library)。C-文库具有文库具有组织细胞特异性。组织细胞特异性。 从从mRNA反转录合成反转录合成cDNA构建基因文库获取目的构建基因文库获取目的基因存在的问题基因存在的问题费时费事费时费事内含子序列内含子序列反转录人工合成互补反转录人工合成互补DNA方法的优势方法的优势 获取的获取的DNA片段往往是片段往往是 具有特定功能的目的基因具有特定功能的目的基因聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)如已知目的基因两如已知目的基因两端的序列,则可采端的序列,则可采用聚合酶
7、链反应技用聚合酶链反应技术,在体外合成目术,在体外合成目的基因。但此法可的基因。但此法可能会造成克隆的目能会造成克隆的目的基因碱基序列的的基因碱基序列的改变。改变。 载体载体DNA的选择的选择理想载体的基本条件:理想载体的基本条件:可转移性可转移性,为目的基因提供进入受体细胞的为目的基因提供进入受体细胞的转转移移能力。能力。合适的复制位点合适的复制位点,为目的基因提供在受体细胞为目的基因提供在受体细胞中的中的复制能力或整合能力复制能力或整合能力。多克隆位点:广泛、特异多克隆位点:广泛、特异选择标志,便于筛选和鉴定选择标志,便于筛选和鉴定分子较小,可容纳较大的外源分子较小,可容纳较大的外源DNA
8、质粒质粒噬菌体噬菌体腺病毒载体腺病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体种类:种类:质粒载体的一般结构质粒载体的一般结构存在于细菌存在于细菌染色体外的染色体外的小型环状小型环状DNADNA分子。分子。具有具有自我复自我复制制功能。功能。带有抗性基带有抗性基因及表型识因及表型识别等别等遗传性遗传性标记物标记物。经改造后具经改造后具有有多克隆位多克隆位点。点。DNA重组的基本模式重组的基本模式载体和目的基因的切断载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内切酶通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),简称限制酶,分别对载体,简称限制酶,分别对载体DNA和目的基因进行切断
9、,以便于重组。和目的基因进行切断,以便于重组。限制酶目前已经发现限制酶目前已经发现400多种,所识别的顺序多种,所识别的顺序往往为往往为4-8个碱基对,且有回文结构。个碱基对,且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出突出粘性末端和粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成突出粘性末端三种情况。形成粘性末端粘性末端(cohesive end)者较有利于载体者较有利于载体DNA和目的基因的重组。和目的基因的重组。 酶切酶切 -双酶切:双酶切:体系体系:选择合适的缓冲体系,尤其是双酶切反应中。:选择合适的缓冲体系,尤其是双酶切反应中。DNA:经过纯化的,尽
10、量不含有蛋白质,酒精等:经过纯化的,尽量不含有蛋白质,酒精等杂质。杂质。时间时间:一般为:一般为5-7h,载体,载体overnight以保证酶切完全。以保证酶切完全。不能时间过长,以防止内切酶的不能时间过长,以防止内切酶的star活性,降低特活性,降低特异性。异性。酶切之后立即回收,小片段用酶切之后立即回收,小片段用PCR-purification Kit 除去,除去,大的片段要用切胶回收去除。大的片段要用切胶回收去除。T-vectorT-vector两条链的两条链的5端含有一个游离的端含有一个游离的TPCR过程中,普通的过程中,普通的Taq酶可在产物的酶可在产物的3端多加一个端多加一个ADN
11、A重组的基本模式重组的基本模式(一)粘性末端连接法:(一)粘性末端连接法:当载体当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行和目的基因均用同一种限制酶进行切断时,二者即可带有相同的粘性末端。如将切断时,二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起,二者即可通过粘载体与目的基因混合在一起,二者即可通过粘性末端进行互补粘合,再加入性末端进行互补粘合,再加入DNA连接酶,即连接酶,即可封闭其缺口,得到重组体。可封闭其缺口,得到重组体。较少的情况下,对产生的平端也可直接进行连较少的情况下,对产生的平端也可直接进行连接。接。 载体载体DNA与目的基因的连接与目的基因的连接(二)人工接尾法:(二
12、)人工接尾法:即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无法得到相同得采用同一种限制酶进行切断,无法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。粘性末端时,可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核在末端核苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的苷酸添加于载体或目的基因的3-端,如载体上端,如载体上添加一段添加一段polyG,则可在目的基因上添加一段,则可在目的基因上添加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,故二者即可通
13、过碱基互补进行粘合,再由再由DNA连接酶连接。连接酶连接。 末端转移酶(末端转移酶(terminal transferase) 该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶(该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase),它所催化的反应与),它所催化的反应与DNA pol I 相似,所不同的是它不需要模板,它可相似,所不同的是它不需要模板,它可以含有以含有的片段为引物,在的片段为引物,在端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头上合成一段寡聚核苷酸,从而形成粘性平头上合成一段寡聚核苷酸,从而形成粘性末端。
14、末端。(三)人工接头连接法:(三)人工接头连接法:将人工连接器(将人工连接器(linker,即一段人工合成的含有,即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子多种限制酶切点的小分子DNA片段,约片段,约1020个个核苷酸)连接到平末端核苷酸)连接到平末端DNA分子分子(载体和目的基载体和目的基因因)上,即有可能使用同一种限制酶对载体和目的上,即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断,得到可以互补的粘性末端。基因进行切断,得到可以互补的粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。点。连接体系的建立:连接体系的建立:温度:粘末端连接:温度
15、:粘末端连接:12-18 (16-20 hours) 平末端连接:室温(低于平末端连接:室温(低于30)DNA量:载体分子数量:载体分子数/目的基因分子数目的基因分子数=1:3-5酶量:平端连接时需加大酶量酶量:平端连接时需加大酶量 连接反应体系越小越好,相对而言,酶切体系稍大连接反应体系越小越好,相对而言,酶切体系稍大较好较好连接失败后连接失败后-一步一步向上游检测问题所在,所以分子一步一步向上游检测问题所在,所以分子 克隆部分克隆部分“留一半留一半”的原则有时候是很有用的。的原则有时候是很有用的。酶切是否完全,所以要做载体的自连对照。酶切是否完全,所以要做载体的自连对照。载体酶切回收是否考
16、虑到切除片段的大小,载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小,是否要用切胶回收更保险。是否要用切胶回收更保险。DNA重组的基本模式重组的基本模式宿主菌或受体细胞宿主菌或受体细胞原核系统原核系统 -大肠杆菌大肠杆菌 -枯草杆菌枯草杆菌真核系统真核系统 -酵母菌酵母酵母菌酵母 -昆虫细胞昆虫细胞 -哺乳动物细胞哺乳动物细胞原核细胞的转化(细菌转化)原核细胞的转化(细菌转化)限制缺陷型限制缺陷型: 避免修饰和降解避免修饰和降解重组缺陷型:重组缺陷型: 避免重组整合避免重组整合转化亲和型:转化亲和型: 较高的可转化性较高的可转化性遗传互补型:遗传互补型: 利于筛选利于筛选感染缺陷型:感染缺陷型: 防止感染
17、防止感染感受态细胞感受态细胞(competent cell)所谓感受态,所谓感受态, 就是细菌吸收转化因子的生理状就是细菌吸收转化因子的生理状态。态。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(分子进入的感受态细胞(Competent
18、cells)。)。大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备( 化学方法化学方法)大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞CaClCaCl2 2处理处理 目前常用的感受态细胞制备方法是目前常用的感受态细胞制备方法是CaCl2法法, CaCl2 法简便易行法简便易行,且其转化效率完全可以满足且其转化效率完全可以满足一般实验的要求一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用制备出的感受态细胞暂时不用时时,可加入占总体积可加入占总体积15的无菌甘油于的无菌甘油于-70保存保存(半年半年),因此因此CaCl2法为使用更广泛。法为使用更广泛。一、一、 受体菌的培养受体菌的培养 从
19、从LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落单菌落,接种于接种于3-5ml LB液体培养基中,液体培养基中,37下振荡培养下振荡培养12小时左右小时左右,直至对数生直至对数生长后期。将该菌悬液以长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于的比例接种于100ml LB液液体培养基中,体培养基中,37振荡培养振荡培养2-3小时至小时至OD600 0.5左右。左右。 二、二、 感受态细胞的制备感受态细胞的制备 ( CaCl2 法法) 将培养液转入离心管中将培养液转入离心管中,冰上放置冰上放置10分钟,然后于分钟,然后于4下下3000g离心离心10分钟。分钟。弃去上清
20、弃去上清,用预冷的用预冷的0.05 mol/L的的CaCl2 溶液溶液10ml轻轻悬浮轻轻悬浮细胞细胞,冰上放置冰上放置15-30分钟后,分钟后,4下下3000 g离心离心10分钟。分钟。 弃去上清弃去上清,加入加入4ml预冷含预冷含15%甘油的甘油的0.05 mol/L的的CaCl2 溶溶液液,轻轻悬浮细胞轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成感受态细胞分装成200l的小份的小份,贮存于贮存于-70可保存半年。可保存半年。 感受态细胞的制备的操作步骤感受态细胞的制备的操作步骤 为了提高转化效率为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几
21、个重要实验中要考虑以下几个重要因素:因素:细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于的的培养菌,最好从培养菌,最好从70或或-20甘油保存的菌种中直接转甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制。来控制。DH5菌株的菌株的OD600 为为0.5时时,细胞密度在细胞密度在5107 个个/ml左左右右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高这时比较合适。密度
22、过高或不足均会影响转化效率。或不足均会影响转化效率。试剂的质量试剂的质量: 所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的(GR.或或AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗最好分装保存于干燥的冷暗处。处。 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行件下进行, 所用器皿所用器皿, 如离心管如离心管, tip头等经高压灭菌处理头等经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNA酶或酶或杂杂DNA所污染所污染, 否则均会影响转化效率
23、或杂否则均会影响转化效率或杂DNA的转入的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞得到噬菌斑或单菌落得到噬菌斑或单菌落与重组与重组DNADNA共同冰浴共同冰浴而后而后4242短暂热刺激短暂热刺激CaClCaCl2 2处理处理50-100mmol/LCaCl2 转转 化化从从-70冰箱中取冰箱中取200l感受态细胞悬液感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。冻后立即置冰上。加入加入pBS质粒质粒DNA溶液溶液(含量不超过含量不超过50 ng,体积不超过体积不超过10l
24、),轻轻摇匀,冰上放置轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。分钟后。 42水浴中热击水浴中热击90秒或秒或37水浴水浴5分钟,热击后迅速置于冰分钟,热击后迅速置于冰上冷却上冷却3-5分钟。分钟。 向管中加入向管中加入1ml LB液体培养基液体培养基(不含不含Amp),混匀后,混匀后37振荡振荡培养培养1小时,使细菌恢复正常生长状态小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗并表达质粒编码的抗生素抗性基因生素抗性基因(Ampr )。 将上述菌液摇匀后取将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含涂布于含Amp的筛选平板上,正的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养面向上放置半小时,
25、待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿皿,37培养培养16-24小时。小时。 计算转化率。计算转化率。转化的操作步骤转化的操作步骤 为了提高转化效率为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因实验中要考虑以下几个重要因素:素: 用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源入的外源DNA的量过多或体积过大时的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。1 ng的的cccDNA即可使即可使50l 的感受态细胞达到饱和。当所的感受态细胞达到
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