最新细胞培养无菌操作主题讲座课件.ppt

1、目录 无菌 定义：对一个环境所谓的无菌，是指在环境中一切有生命活动的微生物的营养细胞及其芽胞或孢子都不存在 无菌技术 定义：无菌技术是细胞工程的基本技术包括实验器具和材料的准备、培养室和超净台的消毒、洗手和着装、无菌操作等 意义：因体外培养细胞没有抗感染能力，防止污染则是决定培养成功与否的首要条件，即便是在设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。为在一切操作中尽可能保证无菌，每一项工作我们都必须做到有条不紊和完全可靠。 消毒灭菌 消毒：是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常用化学的方法来达到消毒的作用。用于消毒的化学药物叫做消毒剂。 灭菌：杀灭或除去特

2、定环境或物品中一切微生物的过程。目前标准规定，灭菌过程必须使灭菌物品污染的微生物存活率减少到10-6及以下。消毒剂种类 依据化学成分主要分为9种 醛类消毒剂 杂环类消毒剂 含氯消毒剂 过氧化物类消毒剂 含碘消毒剂 季铵盐类消毒剂 酚类消毒剂 胍类消毒剂 醇类消毒剂 重金属类消毒剂 生物类消毒剂消毒 新洁尔灭消毒液原理：新洁尔灭灭菌原理为破坏细胞膜、改变其渗透性而起杀菌作用 84消毒液84消毒液是一种以次氯酸钠为主的高效消毒剂，主要成分是次氯酸钠，次氯酸钠的漂白性是其与水反应生成的次氯酸所带来的，因次氯酸具有极强的氧化性，能够将大多数物质氧化，使其变性，因而能起到消毒作用消毒 75%酒精消毒原理

3、 酒精之所以能消毒是因为酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变性凝固，从而达到杀灭细菌的目的。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。75%的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐不断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细菌，酒精浓度低于75%时，由于渗透性降低，也会影响杀菌能力。洁净级别无菌药品生产所需的洁净区可分为4个级别 A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单向流操作台

4、（罩）维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。应当有数据证明单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使用较低的风速。 B级：指无菌配制和灌装等高风险操作A级洁净区所处的背景区域。 C级和D级：指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。实验器具和材料的准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作计划，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需耗材物品及试剂，清点无误后将其放置在操作场所进行消毒处理。 凡是需要带入安全柜（超净台）的培养基、胰酶、培养皿（培养瓶）等耗材和试剂在经过消毒处理之后再用75%的酒精棉球

5、擦拭表面。培养室的消毒进入无菌实验室前先穿好无菌服、戴帽子及口罩无菌实验室每周用0.2%的新洁尔灭拖洗地面、粘尘杆去除灰尘，再用臭氧消毒室内台面要保持洁净，做完实验后用75酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等实验所用物品尽可能一次性准备好，避免多次出入洗手和着装洗手和着装洗手和着装洗手和着装无菌操作个人防护 在实验室工作时必须使用个体防护装备 个人衣服和普通实验服不能穿入细胞培养室内 实验室内不能穿长摆裙，短裙及短裤，不得在实验室内穿露脚趾的鞋子 实验室内严禁处理和配戴眼镜 严禁穿着细胞培养室专用防护服离开实验室 发生手套破损应立即更换无菌操作超净台

6、的消毒 超净工作台台面每次实验前要用75%酒精擦洗，然后用紫外线消毒30min 在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线 消毒时工作台面上用品不可过多堆放，否则会遮挡射线降低消毒效果 一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒超净工作台 超净台是做一般对人体没有直接伤害的常规细菌的操作实验，正压送风，工作台工作区域的气流形成为水平层流型。区内空气经初效过滤器过滤后，由风机压入静压箱，再经高效过滤器过滤，由此送出的洁净气流，以一定的均匀断面风速通过操作区将尘埃颗粒带走，从而形成高洁净的工作环境。超净空气的流速为，这已足够防止附近空气可能袭

7、扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒生物安全柜 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到室外，是过滤在生物安全柜的顶部漏器上，从排风量上可以分为，50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜内所形成的几乎没有微生物的环境中，尽量避免使用明火，酒精灯的火焰可能会影响室内的气流平衡。无菌操作器皿的消毒 所有用到的器皿（买时已灭菌的除外）都必须经过高压灭菌烘干后才能放入超净台内 已灭菌的、外包装完好的培养瓶、离心管、冻存管等可以表面经75%酒精擦拭后直接放入超净台 凡是带入超净工

8、作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面无菌操作细胞处理 超净台经过30min紫外灭菌后，才能打开通风装置 开始工作的第一步就是点燃酒精灯，之后的一切操作都需在火焰近处并经过烧灼进行，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸，继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿内部，如已接触，则取备品更换 不同种细胞实验分次处理，以免交叉污染无菌操作细胞处理 培养瓶打开后，应平放在台面，瓶口保持斜向上 打开的培养液瓶口也应保持适度倾斜放置，避免瓶口垂直放置

9、在具体操作过程中，也应注意所有的瓶口保持倾斜，手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉 吸取营养液、 PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染无菌操作物品摆放为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央培养的细胞较多时，打开的培养瓶盖应按照一定的顺序摆放，保证瓶子之间的盖子不会乱盖无菌操作培养瓶的拿取 从培养箱内取培养皿或培养瓶之前，先用酒精消毒双手，再取培养皿或培养瓶 做镜下观擦时，保持盖子是拧紧状态 操作结束后，培养瓶先

10、拧紧瓶盖，经75%酒精擦拭后放入培养箱 培养瓶盖、胰酶瓶等的盖子只有在要取液时方能打开，取完后立即烧灼旋紧。无菌操作结束后消毒 实验结束后，规范熄灭酒精灯，用75%酒精棉球擦拭超净台内部，操作区域至少擦拭3次 超净台外部，操作口处用75%酒精棉球擦拭 消毒结束后，拉下超净台玻璃门，打开超净台紫外30min 离开培养室时，注意关闭照明灯，打开紫外灯污染及其防治处理 化学污染物（培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂） 生物污染物（细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染）生物污染细菌 细菌：是一大类广泛存在的单细胞微生物。直径一般为几个微米，外形多样（球状、杆状盒螺旋状）

11、。培养物被细菌污染后，几天内即可通过简单的肉眼观察发现：被感染的培养物通常呈浑浊状，在低背景下可见移动的微小颗粒，高倍镜下可分辨各个细菌的形状。生物污染酵母 酵母是真菌界的一种单细胞真核微生物,大小从数微米到40微米不等。与细菌污染类似。在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒。有些会芽生出较小的颗粒。生物污染霉菌 霉菌是真菌界的一种真核微生物，已被称为菌丝的多细胞丝状体形式生长。一般情况下，霉菌污染是较易发现辨别的。生物污染病毒 病毒是一种微观感染性物质，利用宿主细胞结构进行复制。病毒体积极小，因此要检测培养物中有无病毒以及将其从细胞培养实验室所用试剂中去除都十分困难。通过电子显微镜检查、一组

12、抗体的免疫染色、ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞培养物的病毒污染。生物污染支原体 支原体是一种没有细胞壁的简单细菌，被认为是能够进行自我复制的最小微生物。由于体积极小，支原体的检测十分困难。唯一切实有效的检测支原体污染的方法就是采用荧光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自显影或者微生物学测定技术定期检测培养物。无支原体细胞支原体感染细胞用荧光染料Hoechst33258染色，此染料能与DNA特异结合，可是支原体内DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在细胞周围或附于细胞表面合生物污染交叉污染 交叉污染虽不如微生物污染普遍，但许多细胞系与HeLa细胞及其他

13、生长迅速的细胞系间广泛的交叉污染是一个明确的问题会造成严重后果。细胞的生长特性、形态会发生变化。无法进行实验研究。 在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细菌带到培养液中污染其他细胞 细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养污染防治 在生产过程中，从器皿的洗涤、生产所需物品的准备到细胞的生产所有的工作人员必须按照GMP和标准操作规程完成各项工作。 无菌环境，确保细胞生产过程中的无菌，禁止在无菌间内堆放杂物；每天生产结束时必须对无菌间进行清场，并用消毒剂擦拭操作台、地面、墙面 当发现有污染细胞时，及时排查原因，例如：检查器皿和胶塞灭菌是否完全，所有的培养液是否合格等。查找到原因及时纠正。 出现大规模的污染时，必须果断的将现有的细胞全部淘汰， 重新培养新的细胞；在处理污染细胞的同时对无菌间进行臭氧消毒；所用的物品全部再次进行高压灭菌。谢谢观看！谢谢观看！