转基因实验技术培训课件.ppt

1、转基因实验技术转基因实验技术一、转基因动物的概念一、转基因动物的概念 所谓转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受所谓转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，后改用注入受精卵的任何一个精卵或其囊胚细胞中，后改用注入受精卵的任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（雌性动物（foster mother）的子宫内）的子宫内, 使之发育成具表使之发育成具表达目的基因的胚胎动物达目的基因的胚胎动物, 并能传给下一代。这样

2、，生育并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体。的稳定存在而赋于子代动物个体。2转基因实验技术1.11.1 转基因转基因技术发展简介技术发展简介转基因动物的出现是重组转基因动物的出现是重组DNA技术和胚胎技术发展的必然结果。重组技术和胚胎技术发展的必然结果。重组DNA技术的技术的出现，使人类首次可以分离并扩增足够数量的遗传物质出现，使人类首次可以分离并扩增足够数量的遗传物质DNA。早在早在20世纪世纪60年代末和年代末和70年代初，就有人向蛙卵和小鼠胚胎注射年代初，就有人向蛙卵和小鼠胚胎注

3、射mRNA，研究，研究 mRNA能不能在动物卵细胞和早期胚胎中翻译。能不能在动物卵细胞和早期胚胎中翻译。1974年，年，Jaenisch和和Mintz首次报道通过向移植之前的小鼠囊胚注射首次报道通过向移植之前的小鼠囊胚注射SV40的的DNA，在发育成的幼鼠体内检测到了在发育成的幼鼠体内检测到了SV40DNA序列的存在。序列的存在。1976年，年，Jaenisch又报道了通过用反转录病毒感染小鼠的胚胎，使病毒又报道了通过用反转录病毒感染小鼠的胚胎，使病毒DNA整合整合到小鼠的基因组中。到小鼠的基因组中。1980年，年，Gordon等人首先报道了用显微注射纯化等人首先报道了用显微注射纯化DNA的方

4、法，获得了转基因小的方法，获得了转基因小鼠。鼠。但是，在这些早期的实验中，使用的基因结构未曾认真地设计和构建，大多是但是，在这些早期的实验中，使用的基因结构未曾认真地设计和构建，大多是使用容易得到的材料进行试验，实验结果仅仅表明使用使用容易得到的材料进行试验，实验结果仅仅表明使用DNA显微注射的方法可以显微注射的方法可以将外源基因导入小鼠种系之中。并没有检测被导入的基因的生理作用。将外源基因导入小鼠种系之中。并没有检测被导入的基因的生理作用。3转基因实验技术1982年，英国的年，英国的自然自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术

5、，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的培育出具快速生长效应的“转基因转基因超级鼠超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。倍，体积大一倍。4转基因实验技术1.2 1.2 转基因的方法转基因的方法5转基因实验技术1)1)显微注射法显微注射法: : 将将DNADNA注射到胚胎的细胞核注射到胚胎的细胞核内，再把注射过内，再把注射过DNADNA的胚胎移植到动物体内，使之的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。发育成正常的幼仔。6转基因实验技术2)2)逆转录病毒感

6、染法：逆转录病毒感染法：最早用来得到转基因小鼠的方最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以法，利用逆转录载体将遗传信息以RNARNA分子的形式，在逆转分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。逆转录病毒载体未成为一种主导的转基因技术因为自身的缺陷：逆转录病毒载体未成为一种主导的转基因技术因为自身的缺陷：1）反转录病毒载体容量太小，可以插入的目标基因最大允许）反转录病毒载体容量太小，可以插入的目标基因最

7、大允许长度是长度是8kb；2）逆转录病毒的遗传稳定性很差，诸如缺失、碱基对替换、）逆转录病毒的遗传稳定性很差，诸如缺失、碱基对替换、插入、重组等，会随着复制周期数的增加而增加；插入、重组等，会随着复制周期数的增加而增加；3）滴度低。病毒滴度大多数情况下是通过子代病毒颗粒在靶）滴度低。病毒滴度大多数情况下是通过子代病毒颗粒在靶细胞上的表达水平测定的。细胞上的表达水平测定的。7转基因实验技术3)3)胚胎干细胞法：胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能

8、整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。即为转基因动物。其优点是：在将胚胎干细胞植其优点是：在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择一入胚胎前，可以在体外选择一个特殊的基因型，用外源个特殊的基因型，用外源DNA转染以后，胚胎干细胞可以被转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合克隆，继而可以筛选含有整合外源外源DNA的细胞用于细胞融合，的细胞用于细胞融合，由此可以得到很多遗传上相同由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。的转基因动物。缺点是：许多嵌合体转基因动缺点是：许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有

9、转基因。物生殖细胞内不含有转基因。目前，胚胎干细胞介导法在小目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟。鼠上应用比较成熟。8转基因实验技术显微注射胚胎的逆转录病毒感染ES细胞DNA载体任何克隆的DNA，除去载体序列的完好的线性形式重组的或野生型的逆转录病毒克隆的DNA或逆转录病毒DNA导入显微注射到原核除去透明带后的感染电转移或逆转录病毒感染胚胎发育阶段1-细胞期1-细胞期或稍晚全能性ES细胞胚胎移植输卵管子宫囊胚腔，然后子宫首代的基因型通常非嵌合体镶嵌的嵌合体新生鼠筛查斑点印迹，Southern印迹或PCRSouthern印迹或PCR皮色和Southern印迹或PCRDNA整合拷贝数1200

10、1随选择的方法和导入的DNA而变首代动物可能含转基因的百分比10-305-40可达100新导入DNA的表达经常差增强子诱捕，基因诱捕整合随机，非同源，多拷贝，单位点用逆转录病毒长末端重复（LTRs）显然为随机随机或定点，取决于DNA导入方法首代动物的生殖系遗传经常经常偶尔成问题优点方法简便，许多不同构件均成功表达用逆转录病毒LTRs为单位点同源重组；体外转化选择；用逆转录病毒有多种插入缺点显微注射导致胚胎物理损伤；多拷贝整合；缺乏同源重组插入表达水平低；难达到高滴度组织培养系统困难9转基因实验技术1.3 1.3 转基因动物的应用前景转基因动物的应用前景1 1、研究基因的结构与功能，了解动物生命

11、现、研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。象的内在本质。2 2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。及治疗方法。3 3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。、改善动物生产性能，提高动物育种效率。4 4、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。体药用蛋白。10转基因实验技术11转基因实验技术二、基因敲除动物的概念二、基因敲除动物的概念基因敲除（基因敲除（gene knock outgene knock out）

12、：）：是是8080年代年代初出现的一项新的基因工程技术。采用同源重组的初出现的一项新的基因工程技术。采用同源重组的方法方法, ,用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因常基因, ,再应用转基因方法孵育出转基因动物再应用转基因方法孵育出转基因动物, ,即为即为基因敲除动物。基因敲除动物。12转基因实验技术2.1 2.1 基因敲除的方法基因敲除的方法13转基因实验技术1)1)利用基因同源重组进行基因敲除利用基因同源重组进行基因敲除基因载体的构建基因载体的构建ES 细胞的获得细胞的获得外源外源DNA导入导入选择筛选已击中的细胞选择筛选已击中的细胞ES细胞

13、的囊胚注射细胞的囊胚注射表型研究表型研究得到纯合体得到纯合体14转基因实验技术1.1 1.1 打靶载体的构建打靶载体的构建基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶载体有基因插入型载体基因打靶载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基因置换型载和基因置换型载体体(Genereplacement vector)。把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的把目的基因和与细胞

14、内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标分子都重组到带有标记基因记基因(如如neo 基因，基因，TK 基因等基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。15转基因实验技术现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是及其杂合体，因用。常用的鼠的种系是及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉为这类小鼠

15、具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。1.2 ES1.2 ES细胞获得细胞获得16转基因实验技术1.3 1.3 外源外源DNADNA导入导入外源外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注射法。射法。Capecchi报道，用显微注射法导入可得到很高的转染效报道，用显微注射法导入可得到很高的转染效率，占

16、接受外源率，占接受外源DNA细胞的细胞的1020，但显微注射每，但显微注射每次只能注射一个细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得次只能注射一个细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。到转染。Mansour等研究发现电穿孔可使等研究发现电穿孔可使1的的ES细胞稳定转染。细胞稳定转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶。合力，可用于时空特异性基因打靶。17转基因实验技术1.5 ES1.5 ES细胞的囊胚注射细胞的囊胚注射19转基因实验技术将囊胚移植到假孕母鼠子宫内将囊胚移植到假孕母鼠子宫内20转基因实验技术通

17、过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。的基因的目的。由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。需要进行至少两代遗传。1.6 1.6 嵌合体动物表型研究嵌合体动物表型研究1.7 1.7 得到纯合体基因敲除动物得到纯合体基因敲除动物21转基因实验技术2)2)条件性基因敲除

18、法条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮按钮”，从而使对小鼠基因组的修，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。饰的范围和时间处于一种可

19、控状态。外显子外显子目标外显子PGKneoloxPloxP外显子Mating with CRE mice：CRE外显子外显子loxP外显子FloxP22转基因实验技术23转基因实验技术诱导性基因敲除也是以诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础，但却是利用控制系统为基础，但却是利用控制Cre 表达的表达的启动子的活性或所表达的启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用予时间的控制或利用Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程

20、在时间上的可控性，从而在该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 动物动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型(图图)；干

21、扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。3)3)可诱导的条件性基因敲除法可诱导的条件性基因敲除法诱导性基因敲除优点：诱导性基因敲除优点： 诱导基因突变的时间可人为控制；诱导基因突变的时间可人为控制； 可避免因基因突变而致死胎的问题可避免因基因突变而致死胎的问题 在在2 个个loxP 位点之间的重组率较高；位点之间的重组率较高；如用病毒或配体如用病毒或配体DNA 复合物等基因转移系统来介导复合物等基因转移系统来介导Cre 的表达，的表达，则可省去建立携带则可省去建立携带Cre 的转基因动物的过程。的转基因动物的过程。24转基因实验技术四环素诱导的基因敲除过程

22、示例图四环素诱导的基因敲除过程示例图25转基因实验技术四环素诱导的条件性基因敲除过程示例图四环素诱导的条件性基因敲除过程示例图26转基因实验技术利用随机插入突变进行基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除原理：此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，原理：此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体

23、的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。体可用于细菌基因敲除。27转基因实验技术4)4)基因捕获法基因捕获法基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法，基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法，其原理可见下图。通常基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是其原理可见下图。通常基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo

24、基因，基因，neo 基因插入到基因插入到ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来，从的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100地含有中靶基因。中靶基因地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得或染色体组序列分析来获得此方法的优点：此方法的优点：用常规方法进行基因敲除研究需耗费大量的时间和人力，通常一个基因剔

25、除纯合用常规方法进行基因敲除研究需耗费大量的时间和人力，通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。而利用基因捕获可以建立一个携带随机插子小鼠的获得需要一年或更长的时间。而利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的入突变的ES 细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。此方法的缺点：此方法的缺点：1）只能剔除在）只能剔除在ES细胞中表达的基因单种的细胞类型中表达的基因数目约为细胞中表达的基因单种的细胞类型中表

26、达的基因数目约为I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES细胞表达的基因，因此，在细胞表达的基因，因此，在ES 细胞中进行基因捕获还是大有可为的。细胞中进行基因捕获还是大有可为的。2）用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。）用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。28转基因实验技术基因捕获法的基本原理示意图基因捕获法的基本原理示意图.插入了靶目标的基因转录翻译出无活性的目标蛋白随机插入内含子中插入了靶目标的基因转录翻译出无活性的目标蛋白随机插入内含子中, 需要敲除的靶基因转录翻译

27、出活性蛋白需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白29转基因实验技术基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用1 1、建立生物模型，研究基因调控和基因功能；、建立生物模型，研究基因调控和基因功能；2 2、疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗；、疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗；3 3、提供廉价的异种移植器官；、提供廉价的异种移植器官；4 4、改造生物、培育新的生物品种。、改造生物、培育新的生物品种。30转基因实验技术基因敲除技术的缺陷基因敲除技术的缺陷随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的都已经

28、解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：其原因包括：1）许多基因在功能上是冗余的，）许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个在功能上冗余敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；他成员可以提供同样的功能；2）对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就）对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。无法对这些必需基因进行相应的研究了。31转基因实验技术谢谢 谢！谢！32转基因实验技术33转基因实验技术