细胞生物学研究方法(翟中和第四版)专题培训课件.ppt

1、本章主要内容本章主要内容 细胞形态结构的观察方法 细胞及其组分的分析方法 细胞培养与细胞工程 细胞及其生物大分子的动态变化 模式生物与功能基因组的研究第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 病毒 20-200 nm 支原体 0.1-0.3 m 细菌 0.5-5.0 m 动植物细胞 20-30 m 活细胞多是无色透明无色透明的直径直径 显微镜观察范围显微镜观察范围 肉眼观察范围肉眼观察范围 肉眼 0.2 mm 光学显微镜 0.2 m 电子显微镜 0.2 nm 扫描隧道显微镜 样品制备样品制备技术分辨率分辨率一、光学显微镜一、光学显微镜 (light microscope) 从

2、细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具1. 目镜目镜 2. 准焦螺旋准焦螺旋3. 物镜物镜 4. 载物台载物台5. 反光镜反光镜（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜组成组成 由由3 部分组成：部分组成： 光学放大系统（目镜光学放大系统（目镜与物镜）与物镜） 照明系统（光源和照明系统（光源和聚光镜）聚光镜） 镜架及调节系统镜架及调节系统（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜成像成像 放大的倒立虚像放大的倒立虚像 经物镜形成倒立实像 经目镜进一步放大成虚像（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜分辨率分辨率 分辨率：分辨率：显微镜

3、最重要的性能参数 分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离 普通光学显微镜最大分辨率0.2 m: 光源波长光源波长N : 介质折射率介质折射率, 空气为空气为1, 油为油为1.4: 物镜镜口角物镜镜口角(最大最大140o, Sin/2 最大最大0.94 ) 镜口角是指被观察点射入物镜镜口角是指被观察点射入物镜前透镜的边缘光线之间的夹角。前透镜的边缘光线之间的夹角。 （一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜样品制备样品制备Figure 9-10, 11a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)石蜡切片石蜡切片H.E染色染色

4、（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜 利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞非染色活细胞的观察 A. 当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加 B. 当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜 相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加 “环状光阑”和 “相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜 微分干涉显微镜以平

5、面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别 分辨率比普通光镜提高了一个数量级 录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程Figure 9-9 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)Four types of light microscopy (A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as brigh

6、t-field microscopy (B) phase-contrast microscopy (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy (D) dark-field microscopyFigure 9-8 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)正置显微镜与倒置显微镜比较正置显微镜与倒置显微镜比较组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活

7、细胞，具有相差物镜。后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜基本原理基本原理 荧光：荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜基本原理基本原理 光源和光学系统与普通光学显微镜不同 核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头 滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成1.1.照明方式通常为落射式照明方式通常为落射式 2.2.光源为紫外光或其他短波光源为紫外光或其他短波 长的光长的光 3.3.有两个特殊的滤光片有两个特殊的滤光片 ( (发射滤片和阻断滤片发射滤片和阻断滤片)

8、)荧光显微镜光路系统荧光显微镜光路系统（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜样品制备样品制备 免疫荧光技术免疫荧光技术 荧光素直接标记技术荧光素直接标记技术 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达融合表达 两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜应用应用 在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺纺锤体微管（绿色）锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）中期染色体（蓝色）和原原纤维状蛋白（纤维状蛋白（fibrillarin）（

9、红色）（红色）等结构成分（四）激光扫描共焦显微镜（四）激光扫描共焦显微镜 以激光为光源 聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像 利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像 分辨率比普通荧光显微镜1.41.7 倍（四）激光扫描共焦显微镜（四）激光扫描共焦显微镜 可通过“光学 切片” 叠加后重构出样品的三维结构Figure 9-20 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)(二向的)3D Image Reconstructionzxyzxyzyy荧光显微镜（荧光显微镜（a）和激光扫描

10、共焦显微镜（）和激光扫描共焦显微镜（b）二、电子显微镜二、电子显微镜透射电镜透射电镜 transmission electron microscope, TEM扫描电镜扫描电镜 scanning electron microscope, SEM（一）透射电子显微镜（一）透射电子显微镜 电子束电子束作为光源 电磁透镜电磁透镜聚焦 镜筒高度真空真空 图像通过荧光屏或感光胶片记录1电子显微镜与光学显微镜的基本区别电子显微镜与光学显微镜的基本区别Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

11、 光镜光镜 电镜电镜光源光源 可见光（可见光（300-700nm）电子束电子束 紫外光（紫外光（200nm）分辨率分辨率 200nm 0.2nm透镜透镜 玻璃透镜玻璃透镜 磁透镜磁透镜真空真空 无要求无要求 1.33*10-310-5Pa电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50100千千伏时，电子束波长约为伏时，电子束波长约为0.00530.0037纳米纳米 2电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数 电子显微镜分辨率分辨率可达0.2 nm 电镜的分辨本领分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率3电子显微镜的基本构造电子显微

12、镜的基本构造 电子束照明系统电子束照明系统 成像系统成像系统 真空系统真空系统 记录系统记录系统（二）透射电镜制样技术（二）透射电镜制样技术超薄切片技术超薄切片技术戊二醛和四氧化锇环氧树脂厚度40-50nm重金属盐超薄切片黑白图像超薄切片技术显示的细胞超微结构超薄切片技术显示的细胞超微结构 应用超薄切片技术，几乎可以观察细胞的各种超微结构Figure 9-45 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)（二）透射电镜制样技术（二）透射电镜制样技术负染色技术负染色技术 观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等 重金属

13、盐沉积在铜网上，而样品未被染色样品未被染色（故名负染） 分辨率可达1.5 nm 左右（二）透射电镜制样技术（二）透射电镜制样技术冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术 包括冰冻断裂冰冻断裂与蚀刻复型蚀刻复型两步 观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感 样品不需固定包埋 冰冻蚀刻电镜照片冰冻蚀刻电镜照片 透射电镜照片与冰冻断裂透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较和冰冻蚀刻电镜照片比较电镜三维重构与低温电镜技术电镜三维重构与低温电镜技术 电镜三维重构技术电镜三维重构技术 低温电镜技术低温电镜技术 电子扫描断层成像技术电子扫描断层成像技术核孔复合物核孔复合物（三）扫描电镜技术（三）扫描电

14、镜技术 利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌（三）扫描电镜技术（三）扫描电镜技术 样品利用CO2 临界点干燥法处理 样品观察前喷镀一层金膜 一般扫描电镜的分辨本领仅为3 nmFigure 9-49 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较注意样品制备技术的差异！三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜 探测微观世界物质表面形貌 利用量子力学中的隧道效应 具有原子尺度的高分

15、辨本领 可以在真空、大气、液体等多种条件下工作 非破坏性测量http:/en.wikipedia.org/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png第二节第二节 细胞及其组分的分析方法细胞及其组分的分析方法一、用超离心技术分离细胞组分一、用超离心技术分离细胞组分 差速离心：差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开差速离心差速离心一、用超离心技术分离细胞组分一、用超离心技术分离细胞组分 密度梯度离心：密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形

16、成不同的沉降带二、细胞成分的细胞化学显示方法二、细胞成分的细胞化学显示方法 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量福尔根反应福尔根反应 Feulgen stain 特异显示特异显示细胞内呈紫红色的DNA 的分布的分布 原理：原理：酸水解可以去除RNA，仅保留 DNA，并除去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使 脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂 （Schiffs reagent）反应呈紫红色三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异蛋白的显示可通过抗原抗体特异结合抗原抗

17、体特异结合的方法得以实现 若抗体偶联荧光染料抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察 为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致抗体需偶联电子致密物密物(胶体金)，用电镜观察（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术 直接间接免疫荧光直接间接免疫荧光技术（A） 间接免疫荧光间接免疫荧光技术（B）（二）免疫电镜技术（二）免疫电镜技术 在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位 免疫胶体金技术受到越来越多的青睐四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性 原位杂交：原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置原位杂交技术原位杂

18、交技术 光镜水平 同位素标记或荧光素标记的探针 电镜水平 生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合 FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)五、定量细胞化学分析与细胞分选技术五、定量细胞化学分析与细胞分选技术 流式细胞术 流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光的液滴，在激光束的照射下，这些

19、细胞发出散射光和和荧光荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（。（flow cytometer）。）。http:/ RNA 含量和细胞表面分子含量含量和细胞表面分子含量2. 细胞、细胞组分的分选细胞、细胞组分的分选第三节第三节 细胞培养与细胞工程细胞培养与细胞工程http:/ 分为原代细胞原代细胞和传代细胞传代细胞 细胞系细胞系：有限细胞系和连续细胞系 细胞株细胞株： 基本形态：成纤维样成纤维样细胞

20、和上皮样上皮样细胞 贴壁培养贴壁培养和悬浮培养悬浮培养动物细胞培养动物细胞培养原代细胞原代细胞 110 110代以内的细胞代以内的细胞传代细胞传代细胞 在体外培养条件下持续传代培养的细胞在体外培养条件下持续传代培养的细胞接触抑制接触抑制 贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂 生长的现象生长的现象细胞系细胞系 （Cell line) 极少数细胞在传极少数细胞在传1010代后可渡过危代后可渡过危 机而传下去机而传下去40-5040-50代次并代次并仍保持原来的染色体的二仍保持原来的染色体的二 倍体数量倍体数量及接触抑制行为及接触抑制行为 有限细胞系有限细

21、胞系 永生细胞系：永生细胞系：细胞发生了遗传改变细胞发生了遗传改变(染色体明显改染色体明显改 变变)，有，有癌变癌变特点特点细胞株细胞株（Cell strain) 单个细胞增殖而来，所有细胞具有相单个细胞增殖而来，所有细胞具有相 同的遗传性状同的遗传性状. .目前实验室中常用的几种细胞系目前实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞系名称细胞类型细胞类型来源来源3T33T3成纤维细胞成纤维细胞小鼠小鼠HeLaHeLa宫颈癌上皮细胞宫颈癌上皮细胞人人BHK21BHK21成纤维细胞成纤维细胞叙利亚仓鼠叙利亚仓鼠PtKlPtKl上皮细胞上皮细胞袋鼠袋鼠L6L6成肌细胞成肌细胞大鼠大鼠PC12PC12嗜铬

22、细胞嗜铬细胞大鼠大鼠SP2SP2浆细胞浆细胞小鼠小鼠SP2SP20 0骨髓瘤浆细胞骨髓瘤浆细胞小鼠小鼠CHOCHO卵巢细胞卵巢细胞中国地鼠中国地鼠一、细胞培养一、细胞培养植物细胞培养植物细胞培养 单倍体细胞培养：单倍体细胞培养：用花药或花粉在人工培养基上进行培养，通过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通 过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株一、细胞培养一、细胞培养植物细胞培养植物细胞培养 原生质体培养：原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株二、细胞工程二、细胞工程（一）细胞融合与单克隆抗体技术（一）细胞融合与单克隆抗体技术 细胞融合细胞融合 灭活的病毒

23、 化学物质（如PEG） 电融合 同核体同核体（homokaryon） 异核体异核体（heterokaryon） 合核体合核体（synkaryon）单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备（二）显微操作技术与动物的克隆（二）显微操作技术与动物的克隆 细胞拆合：胞质体，核体 物理法：机械法或短波光 化学法：细胞松弛素 显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等克隆羊多莉的培育克隆羊多莉的培育第四节第四节 细胞及生物大分子的动态变化细胞及生物大分子的动态变化Martin D N , Baehrecke E H Development

24、2004;131:275-284一、荧光漂白恢复技术一、荧光漂白恢复技术 亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联 高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭 由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复 测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率fluorescence photobleaching recovery， FPRFigure 10-36a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)二、单分子技术与细胞生命活动的研究二、单分子技术与细胞生命活动的研究 指在单分子水平上对生物分子的行为(构象变化、相互作用、

25、相互识别等）的实时动态检测以及在此基础上的操纵调控等use optical traps to probe the stepping of single molecules of kinesinFluorescent image of single motor proteins (left): Motion of two diffusing kinesin molecules (green) on a microtubule (red) shown as a time series kymograph. Schematic (right): By dragging diffusing kines

26、in molecules with laser tweezers over a microtubule, the friction force between the motor and its microtubule track can be measured very precisely三、酵母双杂交技术三、酵母双杂交技术 在体内分析蛋白质分析蛋白质蛋白质相互作用蛋白质相互作用 利用转录激活因子的DNA 结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理四、荧光共振能量转移技术四、荧光共振能量转移技术(FRET)分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态S

27、0 (electronic ground state ) 的最低振动能级吸收光能以后，它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级。这过程发生在10-15s时间内被激发的分子，首先释放能量回到S1的最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级，并以光子的形式释放能量，即发射荧光FRET产生的条件产生的条件 D、A都能发荧光 D的发射光谱和A的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠 D和A之间的距离必须小于10nm。FRET 的基本原理 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用 如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光两个蛋

28、白未相互作用相互作用五、放射自显影技术五、放射自显影技术 利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr 或 AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究 两个主要步骤：两个主要步骤：即同位素标同位素标记的生物大分子前体的掺入记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示细胞内同位素的显示根据实验要求选择合适的同位素根据实验要求选择合适的同位素 研究DNA 合成时通常用氚（3H）标记的3H-TdR 研究RNA 合成用3H-U 在研究含硫蛋白分子代谢时，用 35S 标记的蛋氨酸和半胱氨酸 对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪：持续标持续标记记、脉冲标记脉冲标记 显微放射自显

29、影显微放射自显影 电镜放射自显影电镜放射自显影胰岛胰岛B细胞电镜放射自显影结果细胞电镜放射自显影结果3H-亮氨酸脉冲标记完成10分钟后，被标记的胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中3H-亮氨酸脉冲标记完成45分钟后，被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内第五节第五节 模式生物与功能基因组的研究模式生物与功能基因组的研究Figure 1-44 Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition ( Garland Science 2008)一、细胞生物学研究常用的模式生物一、细胞生物学研究常用的模式生物模式生物通常个体较小，容易培养，操作简个体较

30、小，容易培养，操作简 单，生长繁殖快单，生长繁殖快由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物Why do we need model systems? All cells are descended from a common ancestor Simple systems to study a biological question Extrapolate （外推）results to higher organisms Advantageous characteristics found in model organis

31、ms Amenable to genetic manipulation Reproduce rapidly Transparent Defined cell lineage（一）大肠杆菌（一）大肠杆菌 原核细胞，培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行（二）酵母（二）酵母 单细胞真核生物的代表：芽殖酵母和裂殖酵母，生长迅速并且易于遗传操作 常用于白质相互作用、细胞周期、基因表达调控、膜泡运输、细胞分化和衰老等（三）线虫（三）线虫 (Caenorhabditis elegans) 遗传背景清楚、生命周期只有3天，成体只有959个细胞，通体

32、透明，便于胚胎发育中细胞分裂、分化以及细胞的死亡的研究（四）果蝇（四）果蝇 (Drosophila melanogaster) 基因组序列已测定，与人类基因有很高的同源性，在遗传分析、染色体特性研究、胚胎发育的基因调控和细胞分化机制的研究、神经退行性疾病和学习、认知等领域的研究发挥重要的作用（五）斑马鱼（五）斑马鱼 (Danio rerio) 小型脊椎动物。许多基因与人类的基因存在对应关系 3 个月性成熟、产卵多、胚胎体外发育，利于研究胚胎发育过程中细胞行为（六）小鼠（六）小鼠 (Mus musculus) 小型哺乳动物，遗传背景清楚，进化方面最接近人类，用于转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶、RNA 干涉以及疾病模型（七）拟南芥（七）拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 十字花科的植物， 广泛用于植物遗传学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学的研究二、突变体制备技术二、突变体制备技术RNA水平水平 RNA 干扰干扰（RNAi）二、突变体制备技术二、突变体制备技术DNA水平水平 基因敲除基因敲除(knock out) http:/ (proteomics) 技术技术本章小结本章小结 细胞形态观察所用不同类型显微镜的用途、基本原理及其样品制备方法 细胞组分的分离、分析方法 细胞培养与细胞工程技术 细胞及生物大分子的动态变化观测技术 模式生物