DNA重组技术PPT课件.ppt

1、5/23/20221DNA重组技术徐纪茹2011-03-01概述点击输入简要文字内容，文字内容需概括精炼，不用多余的文字修饰，言简意赅的说明分项内容点击输入简要文字内容，文字内容需概括精炼，不用多余的文字修饰，言简意赅的说明分项内容点击输入简要文字内容，文字内容需概括精炼，不用多余的文字修饰，言简意赅的说明分项内容1 12 23 35/23/20223内容提要一、DNA重组与DNA重组技术二、 DNA重组技术发展简史三、主要方法和技术路线四、意义及应用5/23/20224DNA重组与DNA重组技术5/23/20225DNA重组 (DNA recombination) ：DNA分子内或分子间发生

2、的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。5/23/20226转化5/23/20227接合5/23/20228转导5/23/202295/23/202210融源性转换5/23/202211DNA重组技术 (DNA recombinant techniques)：用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。 5/23/202212DNA重组技术的理论基础 19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传

3、因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学 1973年 伯格- -杰克森- -考恩- -鲍耶 DNA分子体外拼接分子遗传学 1953年 沃森- -克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学基因工程5/23/202213DNA重组技术发展简史5/23/202214重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究 限制性核酸内切酶（简称限制酶） 基因载体（简称载体）。 5/23/202215限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用阿尔伯Wemer Arber瑞士生物学家巴塞尔Biozentrum大学1929内森斯Danien Nathans美国微生物学家霍普金斯大学医学院1931史

4、密斯Hamilton OSmith美国微生物学家霍普金斯大学医学院19315/23/2022161952年美国分子遗传学家S.E. 卢里亚在大肠杆菌中所发现的一种限制现象从菌株甲的细菌所释放的噬菌体能有效地感染同一菌株的细菌，可是不能有效地感染菌株乙；少数被感染的菌株乙的细菌所释放的同一噬菌体能有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲。 限制性核酸内切酶（简称限制酶）5/23/202217阿尔伯（Arber,Werner） 研究表明 ，细菌细胞能够通过一种“限制酶”的存在来保护自己，抵御噬菌体的攻击。这种限制酶通过分裂噬菌体的DNA使之大部或全部失活，从而遏制噬 菌体的生长。到1968年，阿尔

5、伯收 集了足够多的关于限制酶的资料，终于能够 证明一种特别的限制酶的存在，它只分裂那些含有为噬菌体所特有的某种序列的核苷酸。5/23/202218内森斯（Nathans, Daniel） 与史密斯合作，研究了能在特定部位分裂DNA分子的酶。这使 人们有可能对已知的大得足以带有遗传 信息的核酸片断进行研究。这项研究于1971年完成，以后又导致了旨在把核酸拆开再按其它结构加以组装 的重组DNA的研究工作。5/23/202219史密斯在研究流感嗜血杆菌从噬菌体P22接受DNA的机制时，于1968年发现了一类新的限制酶，它们分别在特定部位切断DNA分子，因此可用以研究DNA分子中核苷酸的顺序和用于DN

6、A重组技术。 5/23/202220基因载体（简称载体） 主要是质粒和温和噬菌体（见转导）两类。 1952年，英国微生物遗传学家W海斯和美国微生物遗传学家J莱德伯格等在首先认识到大肠杆菌的F因子是染色体外的遗传因子。 1953年，法国学者P弗雷德里克等发现大肠杆菌产生大肠杆菌素这一性状为一种染色体外的大肠杆菌素因子所控制。 1957年日本学者发现了抗药性质粒。后两类质粒都是在遗传工程中广泛应用的质粒。 重组DNA技术中广泛应用的噬菌体是大肠杆菌的温和噬菌体 ，它是在1951年由美国学者E莱德伯格等发现的。 5/23/202221主要方法和技术路线5/23/202222重组DNA技术包括：1.

7、目的基因的获取2. 克隆载体的选择与构建3. 外源基因与载体的连接4. 重组DNA导入受体菌5. 重组体的筛选6. 克隆基因的表达5/23/202223酶切连接转化扩增检测目的基因的获取 克隆载体的构建外源基因与载体的连接（体外重组）重组DNA导入受体菌转化子的筛选和鉴定克隆基因的表达5/23/202224DNA克隆的基本过程 分：分离目的基因 切：对目的基因和载体适当切割 接：目的基因与载体连接 转：重组DNA转入受体菌 筛：筛选出含有重组体的受菌体5/23/202225基因工程技术策略分： 基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 直接分离 cDNA 人工合成 基因文库切： 限制性内切酶 有

8、缺口的载体 目的基因接： 连接酶 粘端连接 平端连接 尾接法 重组体转： 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主筛： 表型筛选 电泳法 核酸杂交5/23/2022265/23/2022275/23/202228 限制性核酸内切酶“分子手术刀” DNA连接酶“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体“分子运输车” DNA重组技术的基本工具 5/23/202229限制性核酸内切酶 DNA聚合酶I 逆转录酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶工具酶5/23/202230限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割

9、双链DNA的一类内切酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。 GGATCC CCTAGG 限制性核酸内切酶“分子手术刀”5/23/202231限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： 钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end)5/23/2022325-端突出粘性末端3-端突出限制性核酸内切酶识别序列长度为48个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end），可用连接酶连接。5/23/202233限制酶5/23/2022345/23/2022355/23/202236 利用限制酶取得具有粘性末端或平整末端

10、的DNA片段； 用机械方法剪切取得具有平整末端的DNA片段，例如用超声波断裂双链DNA分子； 经反向转录酶的作用从mRNA获得与mRNA顺序互补的DNA单链，然后再复制形成双链DNA（cDNA）； 用化学方法合成DNA片段。目的基因5/23/2022375/23/202238载体连接 粘性末端连接 平整末端连接 同聚末端连接,（也称末端转移酶）人工接头分子连接 5/23/202239DNA连接酶“分子缝合针” 连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。 这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单

11、链DNA。 Ecoli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。5/23/2022405/23/202241基因的载体“分子运输车”载体必须具备的条件： 1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接； 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ） 4、对受体细胞无害载体的作用： 1、将外源基因转移到受体细胞中去。 2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的载体有： 质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等5/23/2022425/23/202243 质粒是细菌细胞中自然

12、存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。质粒5/23/202244质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1 3个抗药性基因，以利于筛选。5/23/2022455/23/2022465/23/202247噬菌体（phage）DNA 噬菌体DNA改造系统 gt 系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）M13噬菌体DNA改造系统（含lac Z基因）M13mp系列pUC系列5/23/202248其他柯斯质粒（cosmid）酵母人工染色体载体（yeast artif

13、icial chromosome, YAC）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）5/23/202249质粒载体AmprlacZMCSPT7oriPSP6pGEM3z5/23/202250噬菌体载体 由野生型 噬菌体改建，消除或改变 基因组必须区内的不必要的酶切位点5/23/2022515/23/202252NATURE|Vol 444|21/28 December 2006YAC 酵母人工染色体 容载能力大 350-1000kb 存在嵌合现象，即一个YAC克隆中的DNA片段可能

14、来自两个或多个不同的片段 YAC克隆的稳定性差 转化效率低5/23/202253BAC 细菌人工染色体 细菌人工染色体是由大肠杆菌单拷贝F质粒衍生而成 100-350kb 遗传稳定性高， 易转化，嵌合及 重组现象少 BIBAC, 双元细菌人工染色体 TAC，可转化人工染色体5/23/2022545/23/202255 转化，用质粒作载体所常用的方法。 转染，用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。 转导，用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。 注射，如

15、果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。 导入宿主细胞 5/23/2022565/23/2022575/23/202258重组DNA分子的转化 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序5/23/202259阳性克隆的筛选和检测目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶载体自连目的基因自连重组体5/23/202260阳性克隆的检测方法 抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序 - - -5/23/202

16、261( (插入失活法) ) 抗药性标记选择BamH5/23/202262 蓝-白筛选（互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码信息（LacZ）。这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。 这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。 宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为互补。 5/23/202263乳糖操纵元 LacZ基因编码半乳糖苷酶 分解XgalBlue product LacZ5/23/202264 互补的检测5/23/20226

17、55/23/202266菌落原位杂交5/23/202267Southern blot5/23/202268Northern blot5/23/202269荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。5/23/2022705/23/2022715/23/202272克隆基因的表达表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离、纯化5/23/2022731.原核表达体系E.coli的标准： 选择标志 强启动子 翻译调控

18、序列 多接头克隆位点E.coli的不足： 缺乏转录后加工机制 缺乏翻译后加工机制 表达产物形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶性蛋白5/23/2022742.真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区积累缺点：操作技术难、费时、不经济转染：将表达载体导入真核细胞的过程5/23/202275重组DNA技术与医学的关系 疾病基因的发现 发展生物制药 DNA诊断 基因治疗 遗传疾病的预防5/23/2022765/23/202277提问与解答环节Questions and answers结束语 CONCLUSION感谢参与本课程，也感激大家对我们工作的支持与积极的参与。课程后会发放课程满意度评估表，如果对我们课程或者工作有什么建议和一件，也请写在上边，来自于您的声音是对我们最大的鼓励和帮助，大家在填写评估表的同时，也预祝各位步步高升，真心期待着再次相会！ 谢谢您的观看与聆听Thank you for watching and listening