PCR实验室分区设置及要求-PPT课件.ppt
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1、.1分子生物学实验室设置及要求甘肃省疾病预防控制中心 二一一年四月张林才 .2 在由中华人民共和国卫生部办公厅于2002年1月14日下发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法卫医发200210号文)附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。设计根据.3临床PCR诊断实验室设计方案工作流向专用走廊产物分析区扩增区标本制备区试剂准备区缓冲区缓冲区缓冲区空气流向空气流向空气流向空气流向.4错误的设计.5l临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记,以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。l进入各个工
2、作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区,避免发生交叉污染。.6l在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。此外,当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。l清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因,因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。.7试剂准备区设置要求 超净工作台或试剂配置箱 试剂冰箱 可调移液器一套(四支), 配有带滤芯(防止气溶胶)及无 RNaseRNase酶的吸嘴 无粉的乳胶手套 涡旋器 专用
3、工作服 无菌离心管 .8l下述操作在该区进行:贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。l贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前,应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后,应将其分装贮存备用,避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。.9l含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂,应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来
4、决定。l主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查,评价结果必须有书面报告。对于热启动技术(在第一个高温变性步骤后加入酶),聚合酶也可不包含在主反应混合液中。l在整个本区的实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。此外,操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。.10l严禁用嘴吸取液体,加样器和吸头等必须经高压处理。l工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键,因此可使用可移动紫外灯(254nm波长),在工作完成后调至实验
5、台上6090cm内照射。由于扩增产物仅几百bp,对紫外线损伤不敏感,因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间,最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。.11标本制备区设置要求 生物安全柜 样本冰箱 可调移液器一套(四支), 带滤芯(防止气溶胶)及无RNaseRNase酶的吸嘴 台式微型离心机(最大RCF 16000RCF 16000 g g, 最小RCF12500RCF12500 g g); 试管架(Sarstedt 93.1428Sarstedt 93.1428) 无粉的乳胶手套 涡旋器 专用工作服 无菌离心管 加热块.12l下述操作在该区进行:临床标本的保存,核酸(RNA、DNA)
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