生化反应动力学-PPT课件.ppt

1、生化反应动力学生化反应动力学单底物酶反应动力学单底物酶反应动力学多底物酶反应动力学多底物酶反应动力学各种因素对酶反应速度的影响各种因素对酶反应速度的影响微生物代谢调节的生化基础微生物代谢调节的生化基础 生物在表观上所显示的一切生理现象生物在表观上所显示的一切生理现象( (实为体内生物实为体内生物化学反应化学反应) )都与酶的作用密切相关。因此，研究生化都与酶的作用密切相关。因此，研究生化反应动力学也就是研究酶催化反应动力学。反应动力学也就是研究酶催化反应动力学。 微生物的生长和产物的生成都是一系列复杂的酶催化微生物的生长和产物的生成都是一系列复杂的酶催化反应的结果。要了解微生物发酵动力学必须首

2、先了解反应的结果。要了解微生物发酵动力学必须首先了解酶反应动力学。酶反应动力学。 酶动力学主要研究酶催化反应的速度及各种因素（包酶动力学主要研究酶催化反应的速度及各种因素（包括酶浓度、底物浓度、产物、括酶浓度、底物浓度、产物、pHpH值、温度、抑制剂和值、温度、抑制剂和激活剂等）对反应速度的影响，并提出从反应物到产激活剂等）对反应速度的影响，并提出从反应物到产物之间可能进行的历程。物之间可能进行的历程。 单底物、单产物反应；单底物、单产物反应； 酶促反应速度一般在规定的反应条件下，酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示

3、；成量来表示； 反应速度取其初速度，即底物的消耗量反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在很小（一般在5 5以内）时的反应速度；以内）时的反应速度； 底物浓度远远大于酶浓度。底物浓度远远大于酶浓度。（S E）研究前提研究前提一、底物浓度对酶反应速率的影响一、底物浓度对酶反应速率的影响初速度初速度 酶促反应速度逐渐降低酶促反应速度逐渐降低 酶促反应的时间进展曲线酶促反应的时间进展曲线v 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈度的影响呈矩形双曲线关系。矩形双曲线关系。当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。

4、反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应E + S ES P + E（一）中间络合物学说（一）中间络合物学说 k4三个假设：三个假设：（1）E与与S形成形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而复合物的反应是快速平衡反应，而 ES分解为分解为E及及P的反应为慢反应，反应速度取决于的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即慢反应即 Vk3ES。（2）

5、S的总浓度远远大于的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初的总浓度，因此在反应的初始阶段，始阶段，S的浓度可认为不变即的浓度可认为不变即SSt。 （3）P0 忽略忽略 这步反应这步反应 ESE + Pk4E + S ESE + P（二）酶促反应的动力学方程式（二）酶促反应的动力学方程式1、米氏方程的推导、米氏方程的推导v1913年年Michaelis和和Menten提出反应速度与底提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称式，简称米氏方程米氏方程(Michaelis equation)。S：底物浓度：底物浓度V：不同：不同S时的反应速度时

6、的反应速度Vmax：最大反应速度：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数：米氏常数(Michaelis constant) SKSVvmmax 稳态时稳态时ES浓度不变浓度不变 反应速度反应速度 V=k3ES ES的生成速度的生成速度=消耗速度消耗速度 k1ES=k2ES + k3ES E的质量平衡方程的质量平衡方程 E=Et - ESE + S ES P + E()()()稳态时稳态时ES浓度不变浓度不变反应速度反应速度 V=k3ES ES的生成速度的生成速度=消耗速度消耗速度 k1ES=k2ES + k3ESE的质量平衡方程的质量平衡方程 E=Et - ESE +

7、S ES P + EV= V VSKm + S V V=Vmax=k3ESmax=k3EtKm= k2 + k3 k1 a.当当S很小时很小时V=V VS/Km 反应反应V= V VSKm + Sb.当当S很大时很大时V=V VS/S=V V 0 级反应级反应混合混合级级Km=?Km = SV= V VSKm + S若若 VV/2V2V SKm + S1Km + S = 2S2 2、动力学参数的意义、动力学参数的意义（1）米氏常数）米氏常数Km的意义的意义KmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/L。2K

8、m + S Vmax VmaxS Km是酶的特性常数：是酶的特性常数： 与与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶。关，可以鉴定酶。酶酶底物底物Km(mmolKm(mmol/L)/L)脲酶脲酶尿素尿素25溶菌酶溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖乙酰葡萄糖胺胺0.006葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸脱氢酶脱氢酶6-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶苯甲苯甲酰酪氨酰胺酰酪氨酰胺2.5甲甲酰酪氨酰胺酰酪氨酰胺12.0乙乙酰酪氨酰胺酰酪氨酰胺32.0可以判断酶的专一性和天然底物可以判断酶的专一性和天然底物Km值最小的底物

9、值最小的底物最适底物最适底物/天然底物天然底物1/Km近似表示酶对底物的亲和力：近似表示酶对底物的亲和力：1/Km越越大大、亲和力越、亲和力越大大Km= k2 + k3 k1Kmk2（分离能力）（分离能力）/k1（亲合能力）（亲合能力）E + S ES P + EKm越越小小，亲和力越，亲和力越强。强。SS很小时，反应速度就能达到很大。很小时，反应速度就能达到很大。性能优，代谢中这类酶更为重要性能优，代谢中这类酶更为重要k2k3时时 Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径可帮助判断某代谢反应的方向和途径催化可逆反应的酶对正催化可逆反应的酶对正/逆两向底物逆两向底物Km不同不同 Km较小者为主要底

10、物较小者为主要底物根据根据Km：判断某判断某s时时v与与Vmax的关系的关系判断抑制剂的类型判断抑制剂的类型乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（1.710-5）丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶（1.310-3）丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶（1.010-3）丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乙酰乙酰CoA乙醛乙醛丙酮酸浓度较低时：丙酮酸浓度较低时：代谢哪条途径决定于代谢哪条途径决定于Km最小的酶最小的酶一底物多酶反应一底物多酶反应（2）Vmax和和k3（kcat)的意义的意义一定酶浓度下，酶对特定底物的一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一也是一个常数。个常数。S很大时，很大时， Vmax k3E 。k3表示当酶被底物饱和时，每秒

11、钟每个酶分子表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，转换底物的分子数，又称为转换数、催化常数又称为转换数、催化常数kcat kcat越大，酶的催化效率越高越大，酶的催化效率越高（3） kcat/km的意义：的意义：V= V VmaxSKm + SVmax=kcatEt V=kcatEtSKm + S当S Km时，EEt是是E和和S反应形成产物的表观二级速率常数。反应形成产物的表观二级速率常数。 其大小可用于比较酶的催化效率。其大小可用于比较酶的催化效率。kcat/km k3k1k2+k3 kcat/km的上限为的上限为k1,即生成即生成ES的速率，即酶的速率，即酶的催化效率不超

12、过的催化效率不超过E和和S形成形成ES的结合速率的结合速率kcatkcat/km/km的大小可以比较不同酶或同一种酶的大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。催化不同底物的催化效率。（1）Lineweaver-Burk 林林-贝氏双倒数作图法贝氏双倒数作图法3 3、 KmKm与与V V的求取的求取蔗糖酶米氏常数（蔗糖酶米氏常数（Km）的测定）的测定1. 配配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在，在35水水浴保温；

13、浴保温；2. 加入加入3U/ml已在已在35 水浴保温的酶溶液，准确作用水浴保温的酶溶液，准确作用5分钟，终止反应；分钟，终止反应；3. 各吸取各吸取0.5ml反应液与反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷却后在分钟，冷却后在540nm测定吸光度测定吸光度OD值；值；4. 作图作图（2）Eadie-Hofstee作图法作图法v=Vmax-KmvS v VSVmax斜率斜率Km （3）Hanes-Woolf作图法作图法 Sv =SVmax +KmVmax 斜率斜率= 1/Vm-KmVmax=v+vS Km vVmaxS3Km2KmKm（4）Eisenthal和和Cor

14、nish-Bowden线性作图法线性作图法二、多底物的酶促反应动力学二、多底物的酶促反应动力学 分为单底物、双底物和三底物反应分为单底物、双底物和三底物反应1.酶促反应按底物分子数分类：酶促反应按底物分子数分类：有序反应（有序反应（ordered reactions）领先底物领先底物释放释放释放释放A和和Q竞争地与自由酶结合竞争地与自由酶结合（1 1）序列反应或单置换反应）序列反应或单置换反应2.多底物反应按动力学机制分类：多底物反应按动力学机制分类：随机反应（随机反应（random reactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应 A AE PE P E E Q

15、EQ EB B A和和Q竞争自由酶竞争自由酶E形式形式 B和和P竞争修饰酶形式竞争修饰酶形式E A和和Q不同不同E结合结合 B和和P也不与也不与E结合。结合。(2)乒乓反应或双置换反应乒乓反应或双置换反应3.3.双底物反应的动力学方程双底物反应的动力学方程（1）序列机制序列机制的底物动力学方程及动力学图的底物动力学方程及动力学图 在在B的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时A的米氏常数的米氏常数 在在A的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时B的米氏常数的米氏常数 底物底物A与酶结合的解离常数与酶结合的解离常数 底物底物A、B都达到饱和时最大反应速率都达到饱和时最大反应速率（2）乒乓机制乒乓机制的底物动力学

16、方程及动力学图的底物动力学方程及动力学图 在在B的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时A的米氏常数的米氏常数 在在A的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时B的米氏常数的米氏常数 底物底物A、B都达到饱和时最大反应速率都达到饱和时最大反应速率 三、酶的抑制作用三、酶的抑制作用w失活作用失活作用：使酶：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。变性而引起酶活力丧失。w抑制作用抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。：使酶活力下降但不引起变性。w抑制剂抑制剂：能引起抑制作用的物质。：能引起抑制作用的物质。（一）抑制程度的表示方法（一）抑制程度的表示方法V0 ：Vi ：不加入抑制剂时的反应速率不加入抑制剂时的反应速率加入抑制剂后

17、的反应速率加入抑制剂后的反应速率以反应速率的变化表示以反应速率的变化表示1.1.相对活力分数（残余活力分数）相对活力分数（残余活力分数）a =v iv 0 a% =viv0 100 2.相对活力百分数（残余活力百分数）相对活力百分数（残余活力百分数） V0 Vi Vi V03.3.抑制分数抑制分数指被抑制而失去活力的分数指被抑制而失去活力的分数i=1a=1viv0 V0 Vi 4.抑制百分数抑制百分数i=(1a) 100 =（1viv0 ）100 Vi V0 抑抑制制率率 依据依据： 能否用透析、超滤等物理方法能否用透析、超滤等物理方法 除去抑制剂，使酶复活除去抑制剂，使酶复活。不可逆抑制不可

18、逆抑制与与可逆抑制可逆抑制（二）抑制作用的分类（二）抑制作用的分类1 1、不可逆抑制作用、不可逆抑制作用 ： 抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连 很多为剧毒物质很多为剧毒物质 重金属、有机磷、有机汞、有机砷、重金属、有机磷、有机汞、有机砷、 氰化物、青霉素、毒鼠强等。氰化物、青霉素、毒鼠强等。不可逆抑制不可逆抑制不可逆抑制剂不可逆抑制剂 非专一性非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂（作用于一（作用于一/几类基团）几类基团） 专一性专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂（作用于某一种酶的（作用于某一种酶的 活性部位基团）活性部位基团）2、不可逆抑制剂、不可逆抑制剂不可逆

19、抑制不可逆抑制 （1） 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂 重金属离子重金属离子 Ag+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Pb2+ 、 Fe3+ 高浓度时可使酶蛋白变性失活；高浓度时可使酶蛋白变性失活； 低浓度时对酶活性产生抑制。低浓度时对酶活性产生抑制。 通过加入通过加入EDTA解除解除 H2N-CH-COOH CH2 SH H2N-CH-COOH CH2 S-CH2COOHICH2COOHHI烷化剂烷化剂（多为卤素化合物）（多为卤素化合物）+碘乙酸碘乙酸有机磷化合物（敌百虫、沙林）有机磷化合物（敌百虫、沙林）胆碱胆碱酯酶酯酶OHPOC2H5OC2H5S有机磷农药部分+(CH3)3N+

20、CH2CH2OCOCH3(CH3)3N+CH2CH2OH +CH3COOHH2O胆碱乙酰化酶胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱胆碱乙酰胆碱乙酰胆碱积累导致神经中毒症状积累导致神经中毒症状如何紧急救治？如何紧急救治？排毒排毒洗胃、喝鸡蛋清牛奶洗胃、喝鸡蛋清牛奶导泄、利尿导泄、利尿 血液透析（清除游离状态毒物）血液透析（清除游离状态毒物）解毒药：解磷定解毒药：解磷定NCH3CHNOHRO O RO ORO X RO OE P + EOH P + HX有机磷化合物有机磷化合物 羟基酶羟基酶 磷酰化酶磷酰化酶( (失活失活) ) 酸酸RO ORO OE P + -CHNOH磷酰化酶磷酰化酶( (失活失活

21、) )NN+ +CH3 -CHNNN+ +CH3O ORO OR +EOH P解磷定解磷定解毒解毒 - - - - - - 解磷定解磷定(PAM)(PAM)：有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷化合物与酶分子中与酶分子中-SH作用；作用； 可通过加入过量巯基化合物解除。可通过加入过量巯基化合物解除。氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和COCO 与酶中金属离子形成稳定的络合物与酶中金属离子形成稳定的络合物 如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合青霉素（青霉素（penicillinpenicillin） 与细菌糖肽转肽酶与细菌糖肽转肽酶Ser-OHSer-OH活性，活性

22、， 影响细胞壁合成。影响细胞壁合成。（2 2） 专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 KsKs型型 具有底物类似的结构具有底物类似的结构（设计）（设计） 带有一活泼基团：与必需基团反应（抑制）带有一活泼基团：与必需基团反应（抑制） 利用对酶亲合性进行修饰利用对酶亲合性进行修饰 亲合标记试剂（亲合标记试剂（affinity labeling affinity labeling reagentreagent）Kcat型型具有底物类似的结构具有底物类似的结构本身是酶的底物本身是酶的底物还有一潜伏的反应基团还有一潜伏的反应基团“自杀性底物自杀性底物” 抑制作用可通过透析等方法除去。抑制作用可通过透析等

23、方法除去。 原因：非共价键结合原因：非共价键结合可逆抑制可逆抑制竞争性抑制竞争性抑制(competitive inhibition)非竞争性抑制非竞争性抑制(non-competitive I.）反竞争性抑制反竞争性抑制(uncompetitive I.) 3 3、可逆抑制作用：、可逆抑制作用：（1）竞争性（）竞争性（Competitive)抑制抑制 抑制剂（抑制剂（ inhibitor）【举例【举例】G 丙二酸丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶COOH CH2 CH2COOH COOH COOH CH2 丙二酸丙二酸琥珀酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡

24、索酸延胡索酸琥珀酸琥珀酸竞争性抑制竞争性抑制G 磺胺类药物的抑菌机制：磺胺类药物的抑菌机制：与与对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸竞争竞争二氢叶酸合成酶二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氢叶酸二氢叶酸合成酶合成酶二氢叶酸二氢叶酸COOH H2N SO2NHR H2N 磺磺 胺胺 类类 药药 物物利用竞争性抑制是药物设计主要思路利用竞争性抑制是药物设计主要思路磺胺类药磺胺类药抗菌机理：抗菌机理： （与对氨基苯甲酸（与对氨基苯甲酸是结构类似物）是结构类似物）竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。人

25、通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。生物碱麻醉生物碱麻醉竞争性替代竞争性替代生物碱吗啡、海洛因、可卡因、尼古丁 吗啡吗啡 海洛因海洛因麻醉机理源自源自37C37C医学网医学网痛觉神痛觉神经信号经信号阿片阿片鸦片类物质鸦片类物质生物碱竞争性替代脑生物碱竞争性替代脑肽肽麻醉致幻麻醉致幻脑肽脑肽(E)(E)控制痛控制痛觉信号的释放觉信号的释放抑制物抑制物（2）非竞争性（）非竞争性（Non-competitive)抑制抑制无法形成产物wNoncompetitive inhibition（3）反竞争性（）反竞争性（Uncompetitive ）抑制）抑制1：反应体系不加：反应体系不加I2： 体系中加入体系

26、中加入一定量不可逆抑制剂一定量不可逆抑制剂3：体系中加入：体系中加入一定量可逆抑制剂一定量可逆抑制剂v123E(三三)可逆和不可逆抑制作用的鉴别可逆和不可逆抑制作用的鉴别Ev不可逆抑制剂不可逆抑制剂的作用的作用Ev可逆抑制剂可逆抑制剂 的作用的作用I I ( (四）可逆四）可逆抑制作用抑制作用动力学动力学1.1.竞争性抑制竞争性抑制消去消去ES斜率斜率斜率斜率竞争性：竞争性：I与与S与酶活性中心结合机会均等与酶活性中心结合机会均等V下降下降发生抑制发生抑制Km增大增大亲和力亲和力Vmax不变不变S 增大，增大，I结合机率减小结合机率减小Km 变大，变大，Vmax不变不变2.2.非竞争性抑制非竞

27、争性抑制截距截距V下降下降发生抑制发生抑制Km不变不变亲和力不受影响亲和力不受影响Vmax减小减小部分酶始终失活部分酶始终失活Km不变，不变，Vmax变小变小 3. 3. 反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用Km、Vmax都变小都变小四、影响酶催化反应速率的因素四、影响酶催化反应速率的因素底物浓度底物浓度酶浓度酶浓度抑制剂抑制剂上图反映出温度如何影响酶活力？上图反映出温度如何影响酶活力？产产物物累累积积量量 最适温度最适温度 最适温度最适温度w动物酶动物酶 3540w植物酶植物酶 4050w微生物微生物 大部分大部分 4050w个别高温菌个别高温菌 90以上以上（一）温度对酶反应的影响（一）温度对

28、酶反应的影响温度越高，活化分子越多，反应速度快；温度越高，活化分子越多，反应速度快；酶变性时间越短，反应速度下降也迅速。酶变性时间越短，反应速度下降也迅速。钟罩型曲线钟罩型曲线 （二）（二）pH 对酶反应的影响对酶反应的影响w最适最适pH时的酶时的酶活力最大活力最大最适最适pH因酶而异，因酶而异，多数酶在多数酶在7.0左右左右是酶的特性之一是酶的特性之一唾液淀粉酶唾液淀粉酶精氨酸酶精氨酸酶胃蛋白酶胃蛋白酶pHpH对酶活的影响：对酶活的影响： pH的改变破坏酶的空间构象破坏酶的空间构象，引起酶活性的丧失（可逆不可逆）； pH的改变影响酶活性中心催化基团催化基团的解离，从而使得底物转变成产物的过程

29、受到影响； pH的改变影响酶活性中心结合基团结合基团的解离状态，使得底物不能与其结合； pH的改变影响底物底物的解离状态，或者使底物不能与酶结合，或者结合后不能生成产物。 （三）激活剂对酶反应的影响（三）激活剂对酶反应的影响无机离子无机离子阳离子阳离子 K K+ +、CaCa2+2+、NaNa+ +、2+2+、ZnZn2+2+等等阴离子阴离子 ClCl - -、Br Br - -等等中等大小的有机分子中等大小的有机分子某些激酶某些激酶 产物抑制：在酶反应中，产物在释出之前产物抑制：在酶反应中，产物在释出之前可以和酶以复合物可以和酶以复合物(EP)(EP)的形式存在，也即的形式存在，也即产物可以

30、占领酶分子上的特殊位点，从而产物可以占领酶分子上的特殊位点，从而导致酶的催化速度下降。导致酶的催化速度下降。（四）产物对酶反应的影响（四）产物对酶反应的影响根据其化学组成可将酶分为：根据其化学组成可将酶分为： 简单蛋白酶：只需要其蛋白质部分就具有催化功能的酶。简单蛋白酶：只需要其蛋白质部分就具有催化功能的酶。复合蛋白酶：需要有非蛋白成分协助的酶，也称复合蛋白酶：需要有非蛋白成分协助的酶，也称“结合蛋白质酶结合蛋白质酶”复合蛋白酶的非蛋复合蛋白酶的非蛋白成分称白成分称为辅因子为辅因子或辅基或辅基，金属酶需，金属酶需要要MgMg2+2+、FeFe2+2+、ZnZn2+2+等金属作等金属作辅基辅基。

31、（五）辅酶的影响（五）辅酶的影响其它一些酶则需其它一些酶则需要要小分子有机化小分子有机化合物合物如如B B族维生族维生素作为辅因子，素作为辅因子，称为称为辅酶辅酶。 辅酶是某些酶的必需组成部分。辅酶是某些酶的必需组成部分。没有它，酶不表现活性；加入它，在达到酶蛋白和辅酶物质确定的比例以前，活性随加入的辅酶物质的量而成比成比例的升高例的升高。 辅酶物质包括三种类型：辅酶物质包括三种类型：二是辅酶，它与酶二是辅酶，它与酶蛋白结合较松，可蛋白结合较松，可看成是双底物反应看成是双底物反应中的底物之一，也中的底物之一，也可看成是活化剂。可看成是活化剂。一是载体底物，一是载体底物，实际上可看作是实际上可看

32、作是某些双底物酶反某些双底物酶反应中的一种底物。应中的一种底物。三是辅基三是辅基(prothetic(prothetic group)group)，一般与酶蛋白，一般与酶蛋白结合紧密，但对脱去辅结合紧密，但对脱去辅基的酶蛋白来说，它起基的酶蛋白来说，它起着类似活化剂的作用。着类似活化剂的作用。 理解微生物代谢活动理解微生物代谢活动( (途径及其控制途径及其控制) )的意义以的意义以便提出实用的生化问题，并弄清楚环境中哪些因素便提出实用的生化问题，并弄清楚环境中哪些因素有可能影响产品产量，而必须严加控制是很重要的。有可能影响产品产量，而必须严加控制是很重要的。微生物经过长期的自然选择，具备了一套

33、完微生物经过长期的自然选择，具备了一套完美的代谢调节机制，平衡各代谢途径基质的流通量美的代谢调节机制，平衡各代谢途径基质的流通量和反应速率，以适应外界环境的变化。在细胞内，和反应速率，以适应外界环境的变化。在细胞内，除细胞膜水平的底物渗透性外，有酶活性的调节和除细胞膜水平的底物渗透性外，有酶活性的调节和酶量酶量( (合成合成) )的调节两种不同的酶调节机制。的调节两种不同的酶调节机制。五、微生物代谢调节的生化基础五、微生物代谢调节的生化基础一、酶活性的调节一、酶活性的调节 微生物代谢调节的主要方式是通过小分子化合物调节酶促反应的速度。这些小分子化合物一般存在于细胞内，是由细胞自己产生的。通过它

34、们对代谢途径中关键酶活性的抑制和激活作用，有效地控制每种基本代谢过程。 细胞中蛋白质(酶)生物活性的调节可以归纳为以下5种方式：共价修饰、缔合与解离、竞争性抑制、变构(或副位)效应和基因表达。基因表达是一种调节酶量合成，使酶活性发生变动的代谢调节作用(酶的诱导和阻遏)， （一）共价修饰作用（一）共价修饰作用 蛋白质凭借其分子中一个或多个氨基酸残基与一种化学基团进蛋白质凭借其分子中一个或多个氨基酸残基与一种化学基团进行共价连接或拆开，而使其活性发生改变。这种基团通常是磷行共价连接或拆开，而使其活性发生改变。这种基团通常是磷酸根，共价结合部位为丝氨酸残基的酸根，共价结合部位为丝氨酸残基的-CH-C

35、H2 2OHOH。1 1、可逆共价修饰作用、可逆共价修饰作用 细胞中有些酶以活性形式和非活性形式存在，而且两种形式可细胞中有些酶以活性形式和非活性形式存在，而且两种形式可以通过另外的酶的催化作用进行共价修饰而互相转换。以通过另外的酶的催化作用进行共价修饰而互相转换。 酶的可逆性共价修饰作用有两重意义：酶的可逆性共价修饰作用有两重意义： (1)(1)可在短时间内生成大量活性改变了的酶，有效地控制细可在短时间内生成大量活性改变了的酶，有效地控制细胞的代谢状况；胞的代谢状况； (2)(2)可逆修饰更易做到为响应代谢环境的变化而控制酶的活可逆修饰更易做到为响应代谢环境的变化而控制酶的活性。这一系统具有

36、能随机应变的特点，因而处在不断活化和钝性。这一系统具有能随机应变的特点，因而处在不断活化和钝化状态。化状态。2 2、不可逆共价调节、不可逆共价调节 无活性的酶原当功能需要时，被相应的蛋白酶作用切去一无活性的酶原当功能需要时，被相应的蛋白酶作用切去一小段肽链而活化，故又称为酶原激活。小段肽链而活化，故又称为酶原激活。 酶原变为酶是不可逆的，一旦这些生成的蛋白酶完成了它酶原变为酶是不可逆的，一旦这些生成的蛋白酶完成了它们的使命以后，便被降解而不再恢复为酶原。们的使命以后，便被降解而不再恢复为酶原。 这种酶活性的关闭作用是极其重要的，胰蛋白酶原转变成这种酶活性的关闭作用是极其重要的，胰蛋白酶原转变成

37、胰蛋白酶的过程就是这种共价结构不可逆改变的例子。胰蛋白酶的过程就是这种共价结构不可逆改变的例子。( (二二) )缔合与解离缔合与解离 能够进行这种转变作用的蛋白质由多个亚单位组成。蛋白能够进行这种转变作用的蛋白质由多个亚单位组成。蛋白质的活化与钝化是通过组成它的亚单位的缔合与解离实现质的活化与钝化是通过组成它的亚单位的缔合与解离实现的，亚单位缔合后便有活性。这类相互转换有时是由共价的，亚单位缔合后便有活性。这类相互转换有时是由共价修饰或与若干配基结合而启动的。修饰或与若干配基结合而启动的。( (三三) )竞争性抑制竞争性抑制 有些蛋白质的生物活性受代谢物质的竞争性抑制。例如，有些蛋白质的生物活

38、性受代谢物质的竞争性抑制。例如，需要氧化型需要氧化型NADNAD+ +的反应可能受还原型的反应可能受还原型NADHNADH的竞争性抑制；的竞争性抑制；需需ATPATP的反应可能受的反应可能受ADPADP或或AMPAMP的竞争性抑制；有些酶受反的竞争性抑制；有些酶受反应过程中形成的产物的竞争性抑制。应过程中形成的产物的竞争性抑制。( (四四) )变构效应变构效应 变构效应引起的蛋白质在其活化状态与钝化状态之间相互变构效应引起的蛋白质在其活化状态与钝化状态之间相互转变的现象称为变构现象。转变的现象称为变构现象。 变构效应可定义为一种小分子化合物与一种蛋白质分子发变构效应可定义为一种小分子化合物与一

39、种蛋白质分子发生可逆的相互作用，使这种蛋白质的构象发生改变从而改生可逆的相互作用，使这种蛋白质的构象发生改变从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。 变构调节的共同特征：变构调节的共同特征： (1)(1)参与调节酶活性的变构因子是一类能和变构蛋白参与调节酶活性的变构因子是一类能和变构蛋白质分子中某一结构互补结合的分子，又称为调节质分子中某一结构互补结合的分子，又称为调节性分子或效应物。性分子或效应物。 这些效应物一般在结构上与有关酶促反应的底物这些效应物一般在结构上与有关酶促反应的底物或产物迥异。或产物迥异。 大多数情况下，效应物引起的抑制作用是混合型大多

40、数情况下，效应物引起的抑制作用是混合型的，即不同于竞争性、非竞争性或无竞争性抑制的，即不同于竞争性、非竞争性或无竞争性抑制作用。作用。 变构效应的调节机制：变构效应的调节机制： (1)(1)具有一个以上的结合部位。除了结合底物的活性具有一个以上的结合部位。除了结合底物的活性中心外，在同一分子内还存在着分立的能结合其他中心外，在同一分子内还存在着分立的能结合其他一些起抑制作用或活化作用的效应物的部位。一些起抑制作用或活化作用的效应物的部位。 (2)(2)主要部位和副部位可同时被占据。主要部位和副部位可同时被占据。 (3)(3)副部位作用不一定是专一性的，可以结合不同的副部位作用不一定是专一性的，

41、可以结合不同的物质产生不同的效应。物质产生不同的效应。 (4)(4)副部位上的结合可能引起蛋白质分子构象的变化，副部位上的结合可能引起蛋白质分子构象的变化，从而影响主要活性部位的催化活性。从而影响主要活性部位的催化活性。 (5)(5)变构效应构成反馈控制的基础，这种反馈控制机变构效应构成反馈控制的基础，这种反馈控制机制是调节代谢活动的有效方法。制是调节代谢活动的有效方法。 四、代谢调控的解除及在发酵工业上的意义四、代谢调控的解除及在发酵工业上的意义 微生物所具有的自我代谢调节控制能力，对于微生物本身微生物所具有的自我代谢调节控制能力，对于微生物本身的生长繁殖来说是很重要的，但对于人们需要利用微

42、生物的生长繁殖来说是很重要的，但对于人们需要利用微生物来合成、积累代谢产物却是一种障碍。我们需要微生物累来合成、积累代谢产物却是一种障碍。我们需要微生物累积大量的代谢产物，这就要突破微生物的代谢调节。一般积大量的代谢产物，这就要突破微生物的代谢调节。一般采用以下采用以下3 3种方法：种方法： (1)(1)应用营养缺陷型突变株，使合成途径中某一步聚发生应用营养缺陷型突变株，使合成途径中某一步聚发生缺陷，终产物不能积累，控制终产物浓度，解除终产物的缺陷，终产物不能积累，控制终产物浓度，解除终产物的反馈控制，积累中间代谢产物。反馈控制，积累中间代谢产物。 (2)(2)应用抗代谢调节突变株。由于这些突

43、变株的酶蛋白或应用抗代谢调节突变株。由于这些突变株的酶蛋白或操纵基因发生遗传变化，使酶的合成和酶的活性不受终产操纵基因发生遗传变化，使酶的合成和酶的活性不受终产物的影响，因而使终产物能够大量积累。一般是选用对代物的影响，因而使终产物能够大量积累。一般是选用对代谢产物结构类似物有耐性的菌株。谢产物结构类似物有耐性的菌株。 (3)(3)改变细胞膜通透性，使所生成的终产物排泄于体外，改变细胞膜通透性，使所生成的终产物排泄于体外，减少终产物浓度，避免终产物反馈控制。减少终产物浓度，避免终产物反馈控制。 此外，还可采用渗漏缺陷型突变株、条件突变株等。此外，还可采用渗漏缺陷型突变株、条件突变株等。 对生化

44、工程工作者来说，理解微生物代谢活动对生化工程工作者来说，理解微生物代谢活动( (途径及其控制途径及其控制) )的意义以便提出实用的生化问题，的意义以便提出实用的生化问题，并弄清楚环境中哪些因素有可能影响产品产量，并弄清楚环境中哪些因素有可能影响产品产量，而必须严加控制是很重要的。而必须严加控制是很重要的。 微生物经过长期的自然选择，具备了一套完美的微生物经过长期的自然选择，具备了一套完美的代谢调节机制，平衡各代谢途径基质的流通量和代谢调节机制，平衡各代谢途径基质的流通量和反应速率，以适应外界环境的变化。在细胞内，反应速率，以适应外界环境的变化。在细胞内，除细胞膜水平的底物渗透性外，有酶活性的调

45、节除细胞膜水平的底物渗透性外，有酶活性的调节和酶量和酶量( (合成合成) )的调节两种不同的酶调节机制。的调节两种不同的酶调节机制。 现代微生物发酵工业的主要成就即在于可使微生物的代谢产物能现代微生物发酵工业的主要成就即在于可使微生物的代谢产物能够突破细胞自身的调控能力够突破细胞自身的调控能力( (达到失控达到失控) )而过剩生产。所以，了解而过剩生产。所以，了解酶的调节作用对于选育高产菌株和工业发酵的管理具有重大的实酶的调节作用对于选育高产菌株和工业发酵的管理具有重大的实践意义。践意义。 抗生素、氨基酸等工业正是建立在青霉素、谷氨酸等产物的发酵抗生素、氨基酸等工业正是建立在青霉素、谷氨酸等产

46、物的发酵单位能较原始菌株有千百倍地提高的基础之上的。单位能较原始菌株有千百倍地提高的基础之上的。 在生物进化过程中，微生物形成了愈来愈完善的代谢调节机制，在生物进化过程中，微生物形成了愈来愈完善的代谢调节机制，使细胞内复杂的生物化学反应能高度有序地进行和对外界环境条使细胞内复杂的生物化学反应能高度有序地进行和对外界环境条件的改变迅速做出反应。因此，处于平衡生长状态，不会有代谢件的改变迅速做出反应。因此，处于平衡生长状态，不会有代谢产物的积累。产物的积累。 从生物进化的角度看，代谢产物的过量产生，对微生物细胞的能从生物进化的角度看，代谢产物的过量产生，对微生物细胞的能量利用和细胞组成物质的合成来

47、说，都是一种浪费。在自然环境量利用和细胞组成物质的合成来说，都是一种浪费。在自然环境中，只有当条件改变时才会造成微生物积累某些代谢产物，如在中，只有当条件改变时才会造成微生物积累某些代谢产物，如在厌氧条件下酒精、乳酸等的大量形成。通过改变培养条件和遗传厌氧条件下酒精、乳酸等的大量形成。通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变、代谢调节失控而获得某一代谢特性，使微生物的代谢途径改变、代谢调节失控而获得某一代谢产物的过量产生，正是现代发酵工业所研究的主要内容。产物的过量产生，正是现代发酵工业所研究的主要内容。思考题思考题 为什么测酶活力时以测初速为宜，并且底物浓度为什么测酶活力时以测初速

48、为宜，并且底物浓度应大大地超过酶浓度应大大地超过酶浓度? ? 为什么大多数酶的温度、为什么大多数酶的温度、pHpH值对活性影响的曲线值对活性影响的曲线呈钟罩形呈钟罩形? ? 当某一酶促反应速度从最大速度的当某一酶促反应速度从最大速度的10%10%提高到提高到90%90%、95%95%时，其底物浓度要分别作多少改变？时，其底物浓度要分别作多少改变？ 用己糖激酶催化以下反应：用己糖激酶催化以下反应： 葡萄糖葡萄糖+ATP +ATP 己糖激酶己糖激酶6-6-磷酸葡糖磷酸葡糖+ADP+ADP 反应在反应在ATPATP浓度为浓度为5 51010-3-3mol/Lmol/L、MgClMgCl2 2浓度为浓

49、度为5 51010-3-3mol/Lmol/L的溶液中的溶液中进行。在不同的葡糖糖浓度下测定每分钟生成的进行。在不同的葡糖糖浓度下测定每分钟生成的6-6-磷酸葡糖的速度见磷酸葡糖的速度见表，试求该酶促反应的表，试求该酶促反应的KmKm和和VmVm。y = 1E-09x - 2E-08R2 = 0.987500.0000000050.000000010.0000000150.000000020.0000000250.000000030.00000003501020304050葡糖浓度葡糖浓度10-6mol/L33405066100生成生成6-磷酸葡糖速度磷酸葡糖速度(U/min)0.0250.0270.0300.0330.040