引物设计实验课-ppt课件.ppt

1、引物设计引物设计常用软件介绍引物设计常用软件介绍软件的功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能；其次是引物的自动搜索功能。 “Primer Premier”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能。 要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。引物设计与分析软件引物设计与分析软件引物设计

2、软件（ Primer 、Oligo 、codehop、FastPCR、Generunner 、Vector NTISuit、Dnasis、Omiga、Dnastar等）引物分析软件（ Oligo 、Primer、Blast等）Primer Premier 5.0 简介主要功能：主要功能：1. 引物设计引物设计2. 限制性内切酶位点分析限制性内切酶位点分析3. DNA基元（基元（motif）查找）查找4. 同源性分析此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换、 语音提示键盘输入等等。Primer Premier 5.0 使用介绍22.

3、5.23广西医学科学实验中心xy6安装安装Primer premier5Primer premier522.5.23广西医学科学实验中心xy722.5.23广西医学科学实验中心xy822.5.23广西医学科学实验中心xy922.5.23广西医学科学实验中心xy1022.5.23广西医学科学实验中心xy1122.5.23广西医学科学实验中心xy1222.5.23广西医学科学实验中心xy1322.5.23广西医学科学实验中心xy1422.5.23广西医学科学实验中心xy1522.5.23广西医学科学实验中心xy1622.5.23广西医学科学实验中心xy1722.5.23广西医学科学实验中心xy18

4、22.5.23广西医学科学实验中心xy1922.5.23广西医学科学实验中心xy2022.5.23广西医学科学实验中心xy2122.5.23广西医学科学实验中心xy2222.5.23广西医学科学实验中心xy2322.5.23广西医学科学实验中心xy24以肿瘤坏死因子TNF基因为例UCSC Genome Browser是由University of California Santa Cruz (UCSC) 创立和维护的，该站点包含有人类、小鼠和大鼠等多个物种的基因组草图，并提供一系列的网页分析工具。站点用户可以通过它可靠和迅速地浏览基因组的任何一部分，并且同时可以得到与该部分有关的基因组注释信息

5、，如已知基因，预测基因，表达序列标签，信使RNA，CpG岛，克隆组装间隙和重叠，染色体带型，小鼠同源性等。 目标基因序列的获取引物设计功能引物设计功能同源性分析同源性分析蛋白酶体基元和活蛋白酶体基元和活性位点分析性位点分析限制性酶限制性酶切位点分析切位点分析DNA与蛋白序列的互换与蛋白序列的互换序列名称序列名称原始序列原始序列选择一种功能选择一种功能Premier Primer 5提供了提供了8种生物遗种生物遗传密码使用的偏好选择传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）3、支原体（

6、Mycoplasma）4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）DNADNA34intronexonmRNAmRNAAAAAAA 35 pmGpppG 检测的基因如果来自真核生物，需要用检测的基因如果来自真核生物，需要用mRNAmRNA进行引物设计进行引物设计 检测的基因如果为原核生物，其表达一般是要基因序列中不检测的基因如果为原核生物，其表达一般是要基因序

7、列中不含内含子，因此引物设计时直接用基因组含内含子，因此引物设计时直接用基因组DNADNA即可即可希望搜索的引物不会与其它存在于反应中序列发生错配希望搜索的引物不会与其它存在于反应中序列发生错配简并引物设计获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以是两个或者两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号外还出现如R、Y、M、K等其他字母（其中R=A/G,Y=C/T,M=A/C,S=C/G,W=A/T,H=A/C

8、/T,B=C/G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T）。搜索到的引物对数搜索到的引物对数搜索结果搜索结果双击选中一对引物双击选中一对引物选中引物的信息选中引物的信息引物的信息，包括是否出现发夹结构、二聚体等。引物的信息，包括是否出现发夹结构、二聚体等。理想引物应当不存在任何一种上述结构理想引物应当不存在任何一种上述结构引物分值引物分值100分为满分分为满分在此编辑引物在此编辑引物分析编辑结果分析编辑结果接受引物编辑结果接受引物编辑结果返回主窗口返回主窗口接受引物编辑结果接受引物编辑结果返回主窗口返回主窗口打开功能选择打开功能选择“save to database”引物订购输

9、出引物订购输出双击选择需要双击选择需要订购的引物订购的引物引物合成订购表引物合成订购表Primer-BLAST 引物验证引物验证Primer-BLAST 界面包括了界面包括了Primer和和BLAST的功能。的功能。提交的界面主要包括三个部分：提交的界面主要包括三个部分： Target template（模板区） The primers (引物区) Specificity check（特异性验证区）Blast 主 页 ( http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ) 或者或者http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ （已经设

10、计好的引物）（已经设计好的引物）特异性特异性4种数据库：种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)选择此项可以扩增出长短不同的转录本序列选择此项可以扩增出长短不同的转录本序列注意事项：注意事项：1.优先使用参考序列的Gi号或Accession号，确保序列式最新版本（填Accession Number时后面不加版本号就会自动用最新的序列）；2.尽量使用没有冗除的数据库（如refseqrna 或者genome database，这两个数据库是经过专家注释的数据, 这样可以给出更准确的结果 ），nr数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计）；3.指定一个或者几个PCR扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其他不相关的物种影响。