(大学课件)常见的生化与分子生物学技术大串讲.ppt
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1、生物大分子的提取和纯化生物大分子的提取和纯化电泳技术电泳技术PCR技术技术核酸序列的测定核酸序列的测定蛋白质相互作用蛋白质相互作用AgrosePAGE双向电泳 杂交技术酶联免疫技术层析技术、超滤技术、膜技术层析技术、超滤技术、膜技术 检测和纯化检测和纯化分离生命现象生化组分分析1、结构与性质2、功能3、代谢及其细胞调控改造利用生物化学研究技术方法v经典的研究步骤: 分离生化组分(细胞器和生物分子); 分析生化组分的结构; 分析生化组分的功能和代谢(合成与分解)及其相互作用。2022-5-213生物化学研究技术方法l 生物化学研究技术:分离技术:沉淀、吸附、膜分离(过滤、透析等)、离心、层析、电
2、泳等;分析检测技术:电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、分子标记等。分子生物学研究技术:基因重组、分子杂交、PCR与反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。2022-5-214生物大分子分离纯化的一般步骤和原则生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 透析和超滤透析和超滤盐析(盐析(硫酸铵盐析硫酸铵盐析)等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料选择与处理材料选择与处理细胞破碎(机械破细胞破碎(机械破碎、溶账和自溶、碎、溶账和自溶、酶解、化学处理)酶解、化学处理)生物组织生物组织 提取液提取液 粗产
3、品粗产品结晶结晶分子大小分子大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力依据原理依据原理要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有:p 在水和各种有机溶剂中的溶解性。p 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。p固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。p各种物理性质:如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。p其他化学性质:如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。p对其他生物分子的特殊亲和力。分离纯化的一般程序分离纯化的一般程序1、材料的选择和预处理、材料的选择和预处理 2、破碎细
4、胞及提取(有时还需要进行细胞器、破碎细胞及提取(有时还需要进行细胞器的分离)的分离) 3、分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离、分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。处理。生物大分子的浓缩p沉淀法沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂,使有效的成分变为沉淀,经过离心或过滤收集的沉淀物,加少量缓冲液溶解后,在经离心出去不溶物,获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。p盐析法:盐析法:有机溶剂沉淀法;等电点沉淀法;非离子多聚体沉淀法;生成盐复合物沉淀法;热变性沉淀法;酸碱变性沉淀法等 。 p 吸附法吸附法:将干葡聚糖
5、凝胶加入提取液中,由于凝胶吸水,提取液的体积可缩小三倍左右。p 超过滤法:把提取液装入过滤装置,在空气或氮气的压力下,使小分子物质通过半透膜,大分子物质留在膜内。p 透析浓缩法p 减压蒸馏浓缩法:将提取液装入减压蒸馏装置中,在减压真空状态下进行蒸馏。p 冰冻干燥法纯度鉴定纯度鉴定l 生物大分子经过分离提纯,最后还要鉴定制品的纯生物大分子经过分离提纯,最后还要鉴定制品的纯度。度。l 蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有:蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有:SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。心沉降分析法等。
6、l 纯的蛋白质在一定条件下进行电泳,将以单一的速纯的蛋白质在一定条件下进行电泳,将以单一的速度移动,它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋度移动,它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中,应以单一的沉降速度移动。白质在离心场中,应以单一的沉降速度移动。l 选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度,必须同时采用的纯度,必须同时采用2-32-3种不同的方法才能确定。种不同的方法才能确定。蛋白质、核酸的定性定量检测蛋白质、核酸的定性定量检测1、蛋白质的测定、蛋白质的测定 凯氏定氮法(凯氏定氮法(含含N量量 6. 25) 双缩脲法、双缩脲法
7、、Folin-酚法酚法 紫外光度法(紫外光度法( max=280nm) 离心法、电泳法、层析法离心法、电泳法、层析法2、酶活力的测定酶活力的测定 终点法、动力学法终点法、动力学法3、氨基酸的测定、氨基酸的测定 茚三酮法茚三酮法 Sangerf法、法、Edmam法、法、DNS法法4、核酸的测定、核酸的测定 紫外光度法(紫外光度法( max=260nm) 分子杂交法分子杂交法 离心法、电泳法离心法、电泳法l 核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳,沉降分析和紫外吸收法(胺凝胶电泳,沉降分析和紫外吸收法(A260/A280A260/A280)等
8、方法。等方法。v同蛋白质一样,核酸纯度鉴定也必须采用同蛋白质一样,核酸纯度鉴定也必须采用2-32-3种方种方法才能确定。法才能确定。电泳基本原理l 电泳电泳是不同的物质颗粒在是不同的物质颗粒在一定的电场强度一定的电场强度下,由于下,由于所带电荷及颗粒大小形状等不同,因此向相反电极所带电荷及颗粒大小形状等不同,因此向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。l 在一定在一定pH条件下,每一种分子都具有条件下,每一种分子都具有特定的电荷特定的电荷(种类和数量)、(种类和数量)、大小大小和和形状形状,在一定时间内它们,在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同
9、,各自集中到特定的位在相同电场中泳动速度不同,各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理基本原理。电泳带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异,使得带电分子的“泳动”速度不同,因而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。电泳技术有多种方式,但一般根据有无支持物将其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的
10、纸电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳,以及与凝胶(例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶)为支持物的凝胶电泳。等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。l 影响泳动度的因素:影响泳动度的因素:1. 电场强度:l 电场强度是指每厘米的电位降,也称电位梯度电场强度是指每厘米的电位降,也称电位梯度(电势梯度电势梯度)。电场强度越高,则带电颗粒泳动越快。电场强度越高,则带电颗粒泳动越快。2. 溶液溶液pHl 为使电泳时为使电泳时pH值恒定,必须采用缓冲液作为电极液,溶液值恒定,必须采用缓冲液作为电极液,溶液的的pH值决定带电颗粒的解离程度,亦即决定其所带电荷的值决定带电颗粒的
11、解离程度,亦即决定其所带电荷的多少。多少。3.离子强度(离子强度(I) 溶液的溶液的I 越高,质点的泳动速度越慢,但区带分离度却较越高,质点的泳动速度越慢,但区带分离度却较清晰。清晰。4. 电渗电渗l 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗电渗。如纸电。如纸电泳时,滤纸吸附泳时,滤纸吸附OH-OH-离子带负电荷,与纸接触的缓冲液离子带负电荷,与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动,会对颗粒的移动造成不良影响,带正电荷向负极移动,会对颗粒的移动造成不良影响,故电泳时,电渗小些为好故电泳时,电渗小些为好5. 温度温度 电泳时会产生焦耳热,使介质粘度下降,分子运动加快,
12、迁移率电泳时会产生焦耳热,使介质粘度下降,分子运动加快,迁移率增加,同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活,因此电增加,同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活,因此电泳时,要控制电压或电流,也可安装冷却散热装置。泳时,要控制电压或电流,也可安装冷却散热装置。6.支持物支持物| 现代电泳多在固体支持物上进行,使样品中的不同组分形成不同现代电泳多在固体支持物上进行,使样品中的不同组分形成不同的区带,称区带电泳。电泳结束后,支持物可以方便地进行染色的区带,称区带电泳。电泳结束后,支持物可以方便地进行染色等后续处理。等后续处理。电泳技术分类| 按电泳的原理来分,可分为四种:区带电泳区带电泳:电
13、泳过程中,不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带,这是当前应用最广泛的电泳技术。移界电泳:移界电泳:是Tiselius最早建立的电泳,它是在U 形管中进行的,由于分离效果较差,已为其他电泳技术所取代。等速电泳:等速电泳:需专用电泳仪,当电泳达到平衡后,各组分的区带相随并形成清晰的界面,并以等速移动。等电聚焦:等电聚焦:具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度,使被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区带,且分辨率较高。(表面看与区带电泳相似,但原理不同)DNA的琼脂糖凝胶电泳:l 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它
14、们的相对分子相对分子质量及分子构型质量及分子构型,同时与,同时与凝胶的浓度凝胶的浓度也有密切关系。也有密切关系。l 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系l DNA分子的大小:l在凝胶中,DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较,便可测出未知片段的大小。l但是当DNA分子大小超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因此,应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时,分子大小不宜超过此值。l琼脂糖的浓度:不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 2. 琼脂糖
15、凝胶电泳l 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系F不同构型DNA的移动速度次序为:共价闭环DNA(cccDNA)直线DNA开环的双链环状DNAF当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rf = 0),而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rf0),由此可见,这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 聚丙烯酰胺凝胶电泳l聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称称Acr)和交联剂)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(简称(简
16、称Bis)在)在加速剂加速剂和和催化剂催化剂的作用下的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶,以此聚合并联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳胶电泳(简称(简称PAGE)。)。l聚丙烯酰胺凝胶有下列优点:聚丙烯酰胺凝胶有下列优点: 在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好。在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好。 化学性能稳定,与被分离物不发生化学反应。化学性能稳定,与被分离物不发生化学反应。 对对pH和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。 几乎无电渗作用,只要几乎无电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致,则样纯度高,操作条件一
17、致,则样品分离重复性好。品分离重复性好。 样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g。 凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。 分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体,因而较醋酸和电荷效应为一体,因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。电泳等有更高的分辨率。l聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处:聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处:p 分离范围不同分离范围不同 琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质,尤
18、其是核酸;聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质,如蛋白质,氨基酸等。p 凝胶配置程序不同凝胶配置程序不同l琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化,在凝固前到入槽中即可;聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分,并且对聚合温度也有一定的要求,否则会影响凝胶孔径的大小。p 凝胶的厚度不同凝胶的厚度不同l琼脂糖凝胶最薄只能达到;聚丙烯酰胺凝胶可以制成.,分辨率高。p 成本不同成本不同。琼脂糖价格便宜;聚丙烯酰胺凝胶价格较高p 安全性不同安全性不同。琼脂糖没有毒性;聚丙烯酰胺凝胶有毒性l 凝胶聚合的原理及有关特性凝胶聚合的原理及有关特性催化系统常用有两种:催化系统常用有两种:l 过硫酸氨过硫酸氨TEMED化学催化聚合
19、系统化学催化聚合系统此系统中,四甲基乙二胺(TEMED)称为加速剂,它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入,可使过硫酸氨(APS,引发剂)形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应,形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。l 核黄素核黄素TEMED光聚合催化系统光聚合催化系统此系统中,核黄素经紫外线光解形成无色基,再被痕量氧氧化形成自由基,引发聚合反应。TEMED的存在,可以加速聚合,本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。凝胶聚合的原理及有关特性影响凝胶聚合的因素 AP、核黄素、TEMED:是凝胶聚合不可缺少的试剂,是凝胶聚合不可缺少的试剂,AP应在干燥、应在干燥
20、、避光的条件下保存,其水溶液应置棕色瓶中,避光的条件下保存,其水溶液应置棕色瓶中,4冰箱贮存,一般仅冰箱贮存,一般仅能存放一周。能存放一周。TEMED(液状)应密闭贮于(液状)应密闭贮于4冰箱中。增加冰箱中。增加AP和和TEMED可加快聚合速率,但过量的可加快聚合速率,但过量的AP和和TEMED会引起电泳时烧胶会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。内完成。 pH:碱性条件下聚合快,但碱性过强时胶硬而脆,需高碱性条件下聚合快,但碱性过强时胶硬而脆,需高pH时应减少时应减少AP和和TEMED用量,制酸性胶可加用量,制酸性胶可
21、加AgNO3等促进聚合。等促进聚合。 温度:温度高聚合快,但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡,低温温度高聚合快,但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡,低温(5)聚合凝胶会变得脆聚合凝胶会变得脆 而混浊,一般而混浊,一般25-35聚合较好。聚合较好。 氧分子:氧分子阻碍凝胶聚合,故不含氧分子阻碍凝胶聚合,故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气,的凝胶最好先抽真空脱气,再加引发剂。再加引发剂。 PAGE原理l PAGE据其有无浓缩效应,分为据其有无浓缩效应,分为连续系统与不连续系统连续系统与不连续系统两大两大类。类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷及分子筛效应;不连
22、续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pH、凝胶浓、凝胶浓度及电位梯度的不连续性度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应电荷效应、分子筛效应分子筛效应,还具有浓缩效应浓缩效应,故分离效果更好。l不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质,利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性,使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带,然后进行分离。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。 所谓所谓变性凝胶变性凝胶,即在凝胶中加入变性剂,如即在凝胶中加入变性剂,如尿素、尿素、SDS(十二烷基磺酸
23、十二烷基磺酸钠钠)、巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构,等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构,把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。任何电荷。l 由于由于SDSSDS带有大量负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超带有大量负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷,因而消除或掩盖了过了天然蛋白质原有的负电荷,因而消
24、除或掩盖了不同种类蛋白质间不同种类蛋白质间原有电荷的差异,使蛋白质均带有相同密度的负电荷,因而可利用原有电荷的差异,使蛋白质均带有相同密度的负电荷,因而可利用MrMr差异将各种蛋白质分开。差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中,加入在蛋白质溶解液中,加入SDSSDS和疏基乙醇,巯和疏基乙醇,巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原,使多肽分成单个亚单位。基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原,使多肽分成单个亚单位。膜分离基本技术 膜分离与常规的分离技术相比膜分离与常规的分离技术相比 具有无相变化、能耗低、过程简单、不污染环境等优点 特别适用于生物物质、酶制剂及同分异构体等的分离。2022-5-2127
25、膜纵切面模式图膜纵切面模式图以分离应用领域过程分类微滤(micro-filtration, MF)超滤(untra-filtration, UF)反渗透(reverse osmosis, RO)透析(Dialysis, DS)电透析(electro-dialysis, ED)纳米膜分离(NF)亲和过滤(affinity filtration, AF)渗透气化(pervaporation, PV 膜分离基本技术 膜分离过程的推动力是膜分离过程的推动力是静压差、浓度差或者电位差,静压差、浓度差或者电位差,有的分离过程可能是几种推动力都兼而有之。有的分离过程可能是几种推动力都兼而有之。 膜在分离过程
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