荧光光谱分析法-课件.ppt

1、122008年诺贝尔化学奖 下村修现年80岁的下村修1928年出生于日本京都府，1960年获得名古屋大学理学博士学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。他1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。 马丁沙尔菲马丁沙尔菲出生于1947年，现年61岁，是美国哥伦比亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。 瑞典皇家科学院8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家马丁沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学奖，将均分1000

2、万瑞典克朗（约合140万美元）奖金。帮助他们获奖的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实验带来革命，它发出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞层面的诸多反应。 由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息之中，让其随着这些需要跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症对大脑造成的损害、观察有害细菌的生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何产生分泌胰岛素的细胞。 34用荧光抗体染色之用荧光抗体染色之原生动物原生动物澳大利亚科学家最新发现澳大利亚科学家最新发现，一种叫，一种叫“螳螂虾螳螂虾”的海的海里动

3、物通过发出色彩鲜艳里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶，或者吸引性配偶，5K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 23061 nmgreen-fluorescent protein (GFP)6第五章第五章 荧光分析法荧光分析法第一节第一节 第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法第三节第三节 荧光分光光度计荧光分光光度计7 某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光比原来所吸收光的波长更长的光光致发光光致发光（二级光）。（二级光）。光

4、致发光光致发光荧光荧光 fluorescence 磷光磷光 phosphorescence 荧光分析法是根据物质的荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置荧光谱线的位置及其及其强度强度进进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。行物质鉴定和含量测定的仪器方法。 8分子荧光分析的特点：分子荧光分析的特点：1. 灵敏度灵敏度高：高：一般紫外一可见分光光度法的检出一般紫外一可见分光光度法的检出限约为限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至甚至10-12 g/ml。2. 选择性选择性好好3. 线性范围线性范围宽宽4. 应用范围应用范围窄窄91. 分子荧光的产生分子

5、荧光的产生一、分子荧光一、分子荧光 molecular fluorescence分子能级比原子能级复杂分子能级比原子能级复杂在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级室温下大多数分子处于基态的最低振动能层室温下大多数分子处于基态的最低振动能层在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为为+1/2和和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为基态单重态基态单重态,用符号用符号S0表示表示10分子吸收辐射后分子吸收辐射后电子被激发且不发生自旋方向的改变电子被激发且不发生

6、自旋方向的改变ms为为+1/2和和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为激发单重态激发单重态,用符号用符号S表示。表示。 （S1 S2 S3）电子被激发且伴随着自旋方向的改变电子被激发且伴随着自旋方向的改变ms为为+1/2和和+1/2, s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为激发三重态激发三重态,用符号用符号T表示。（表示。（T1 T2 T3）S011 小结：分子能级与跃迁小结：分子能级与跃迁 基态基态(S0)激发态激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位；一次到位； 激发态激发态

7、基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式(见能级图见能级图)；速度最快、激；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大；发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1 、 T2 ；电子能级的多重性电子能级的多重性 M=2S+1 平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定( (洪特规则洪特规则) )，三重态能级比相应，三重态能级比相应单重态能级低；单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态； 12S0S1、S2 允许跃迁；允许

8、跃迁；S0T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图见能级图)；进入的几率小；进入的几率小； 小结：激发单重态与激发三重态的不同小结：激发单重态与激发三重态的不同 激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激发三重态有激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（激发单重态分子平均寿命短（10-810-6s），），而激发三重态而激发三重态的长（的长（10-410s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方

9、向的改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻跃迁跃迁S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 4 外转换l l 3 3T2内转换振动弛豫14激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁跃迁( (发光发光) )和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；荧光延迟荧光磷光辐射跃迁辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁传递途径传递途径内转移外转移系间跨越振动弛豫荧

10、光荧光：10-710-9s，第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态磷光磷光：10-410s； 第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态15辐射和非辐射能量传递过程辐射和非辐射能量传递过程振动弛豫振动弛豫：同一电子能级中，以：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能热能量交换形式由高振动能层至低相邻振动能层间的跃迁层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间。发生振动弛豫的时间1010-12-12s s内转换：内转换：相同多重态的电子能级间的相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁等能级的无辐射跃迁。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电

11、子跃回第一激通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。荧光发射：荧光发射：电子由电子由第一激发单重态的最低振动能层第一激发单重态的最低振动能层基态基态( 荧光多为荧光多为 S1 S0跃迁跃迁)，发射波长为发射波长为 l l3的荧光，的荧光，10-710-9s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长： l l3 l l 2 l l 1 ；系间跨越：系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的

12、生变化的非辐射跃迁非辐射跃迁。 禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1 就可发生系间就可发生系间跨越，通过自旋跨越，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。 10-6s 外转换：外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的转移能量的非辐射跃迁非辐射跃迁。常发生在。常发生在S1或或 T1 S0 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。 磷光发射：磷光发射：电子电子由第一激发三重态的最低振动能级由第一激发三重态的最低振动能级基态基态(T1 S0跃迁跃迁)；发光速度很发光速度很慢慢： 10-

13、4100s、磷光的磷光的能量比荧光小能量比荧光小 电子由电子由S0进入进入T1的过程：（的过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁） S0激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 光照停止后，可持续一段时间光照停止后，可持续一段时间172. 荧光的激发光谱与荧光光谱荧光的激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluorescence spectrum（1 1）荧光的激发光谱）荧光的激发光谱 激发光谱：激发光谱：表示表示不同激发波长不同激发波长下所引起物质下所引起物质发射某一波长荧光发射某一波长荧光的的相对效率。相对效率。 绘制激发光谱

14、：绘制激发光谱：固定发射波长固定发射波长( (选最大发射波长选最大发射波长),),然后以不同波长的然后以不同波长的入射光激发荧光物质，以入射光激发荧光物质，以荧光强度荧光强度F对对激发波长激发波长l l作图作图，即为激发光谱。，即为激发光谱。荧光分子都具有两个特征光谱：荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱激发光谱和和发射光谱（荧光光发射光谱（荧光光谱）谱）。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为度最大，称为最大激发波长最大激发波长 l lex（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）荧光的发射光谱（荧光光谱） 荧光光谱表示在所发

15、射的荧光中各种波长组分的相对强荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时，度。绘制发射光谱时， 使激发光波长使激发光波长固定在固定在l lex处处，然后对发，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以以荧光强度荧光强度F 对发射波长对发射波长l l作图作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。，得发射光谱图（即荧光光谱）。发射光谱（荧光光谱）的位置？发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？磷光光谱的位置？200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲

16、的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱20激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a. Stokes位移位移 荧光光谱总是位于物质荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波激发光谱的长波一侧，即荧光波长大于激发光波长的现象。长大于激发光波长的现象。 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值： 振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。 b. 荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关 电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能

17、量(如能级图如能级图l l 2 、l l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一个发射态，如个发射态，如l l 3 。 为什么？为什么？21c c. . 镜像规则镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。各小峰波长各小峰波长递减值与递减值与振振动能级差动能级差有有关，各小峰关，各小峰的高度与的高度与跃跃迁几率迁几率有关。有关。 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动振动能级分布

18、类似能级分布类似； 基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能级的几率较大的话，级的几率较大的话，相反跃迁也如此相反跃迁也如此。 23二、荧光的产生与分子结构的关系二、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（荧光量子产率（ ）：）：吸收的光量子数发射的光量子数物质的荧光量子产率范围一般

19、是多少?如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%100%。242.有机化合物的分子结构与荧光的关系有机化合物的分子结构与荧光的关系（1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（4）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。2526三、影响荧光强度的因素三、影响荧光强度的因素 relation between fl

20、uorescence and molecular structure 影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素1.溶剂的影响溶剂的影响 同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有所增强。这是因为在极性溶剂中，所增强。这是因为在极性溶剂中，*跃迁所需的能量差跃迁所需的能量差E小，小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度也增强。也增强。

21、 溶剂溶剂粘度粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。升，荧光强度下降。272.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增

22、加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0以下，温度每降以下，温度每降低低10， f增加增加3，在，在 80时，时， f为为1。28 当荧光物质本身是当荧光物质本身是弱酸或弱碱弱酸或弱碱时，溶液的时，溶液的pH值对该荧光物质的值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的光物质都有它最适宜的发射荧光

23、的存在形式，也就是有它最适宜的pH值范围。例如苯胺在不同值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：值下有下列平衡关系：苯胺在苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于的溶液中主要以分子形式存在，由于 NH2为为提高荧提高荧光效率光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH2和和pH13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。 3. 溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；294.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自

24、吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；305.荧光熄灭剂荧光熄灭剂 荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂荧光熄灭剂(quen

25、ching medium)。如如卤素离子卤素离子、重金属离子重金属离子、氧分子氧分子以及以及硝基化合物硝基化合物、重氮化合物重氮化合物、羰基羰基和和羧基化合羧基化合物物均为常见的荧光熄灭剂。均为常见的荧光熄灭剂。316、散射光、散射光 小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。改变而向不同角度散射。瑞利光：瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：拉曼光：光子和物质发

26、生弹性碰撞，发生能量交换，光子光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。而发射出比入射光稍长或稍短的光。散射光对荧光测定有干扰，散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。措施消除。拉曼光的干扰主要来拉曼光的干扰主要来自溶剂自溶剂，当溶剂的拉曼光，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发与被测物质

27、的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长光波长32选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。 b:将空白溶剂分别在320nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。 硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱 33四、荧光试剂四、荧光试剂 荧光试剂荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物

28、质与其反是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析法的使用范围法的使用范围1.1.有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析 脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性，射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物常使

29、弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物( (衍生化衍生化) )。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。34 能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌呤类、能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌呤类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质氨基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等；及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等甾体类如皮质激素及雌醇

30、等；抗生素类如青抗生素类如青霉素、四环素等霉素、四环素等；维生素类如维生素维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗抗坏血酸坏血酸、叶酸及烟酰胺等、叶酸及烟酰胺等。此外，。此外，中草药中的许多有效成分中草药中的许多有效成分，不少，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学

31、研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂： 1荧光胺荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物，典型反应如下：光衍生物，典型反应如下：荧光胺及其水解产物不显荧光。荧光胺及其水解产物不显荧光。100mg荧光胺溶于荧光胺溶于100ml无无水丙酮中，放置水丙酮中，放置24小时后即可使用。取相当于小时后即可使用。取相当于10mg药物的甲醇或药物的甲醇或水溶液水溶液0.lml，加适宜加适宜pH值的磷酸缓冲溶液值的磷酸缓冲溶液5ml，加荧光胺试剂加荧光胺试剂0.lml，

32、混合，放置混合，放置15分钟后测定荧光强度。荧光条件为：分钟后测定荧光强度。荧光条件为：ex=275、390nm，em=480nm。362邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA) 在在2 巯基乙醇存在下，巯基乙醇存在下，pH910的缓冲溶液中的缓冲溶液中OPA能能与伯胺类、特别是除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的与伯胺类、特别是除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的a 氨基酸生成灵敏的荧光产物。取氨基酸生成灵敏的荧光产物。取OPA 500mg溶于溶于10ml乙醇乙醇中，加中，加200ml 2 巯基乙醇，将此混合液加至巯基乙醇，将此混合液加至1L 3的硼酸的硼酸溶液中，再用溶液中，再用KOH调节至调节至pH10，

33、即为常用试剂溶液。荧即为常用试剂溶液。荧光条件为：光条件为：ex=340nm，em=455nm。3731 二甲氨基二甲氨基 5 氯化磺酰萘氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯丹酰氯) 能与伯胺、仲胺及酚基的生物碱类反应生成荧光性产物。能与伯胺、仲胺及酚基的生物碱类反应生成荧光性产物。取取50mg或或100mg试剂，溶解于试剂，溶解于500ml无水丙酮中即可使用。无水丙酮中即可使用。与丹酰氯类似的一个试剂是丹酰肼与丹酰氯类似的一个试剂是丹酰肼(DansylNHNH2)，它能它能与可的松的羰基缩合，产生强烈荧光。荧光条件为：与可的松的羰基缩合，产生强烈荧光。荧光条件为：ex=365nm，em=5

34、00nm左右。左右。 丹酰氯试剂不稳定，其水解产物丹酰氯试剂不稳定，其水解产物Dansyl OH呈蓝色荧光呈蓝色荧光，必须，必须暗处保存暗处保存，每周重，每周重新配新配制。制。382.2.生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析39 无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配合物后，可测量约合物后，可测量约6060种元素及离子种元素及离子 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土采用荧光分析法采用荧光分析法 氟、硫、铁、银、钴、镍氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定采用荧光熄灭法测定 铜、铁、钴、锇及过氧化氢铜、铁、钴、

35、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定采用催化荧光法测定 铬、铌、铀、碲铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定采用低温荧光法测定 铈、铕、锑、钒、铀铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定采用固体荧光法测定2.无机化合物的分析无机化合物的分析40第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系 当一束强度为当一束强度为I0的紫外的紫外/可见光照射一浓度为可见光照射一浓度为c、液层厚液层厚度为度为d的液槽时，可在溶液的的液槽时，可在溶液的各个方向各个方向观察到荧光，其观察到荧光，其 由于能产生荧光的物质占被分析物的数量相当有限，由于能产生荧光的物质占被分析物的

36、数量相当有限，且就这少量的荧光物质几乎在同一波长段产生光致发光，且就这少量的荧光物质几乎在同一波长段产生光致发光，所以荧光法所以荧光法很少用来定性分析很少用来定性分析 吸收光强度为吸收光强度为Ia透过光强度为透过光强度为It荧光强度为荧光强度为FI0It IaF垂直方向垂直方向（= I0 - It ）荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度IaF = K(I0 It) K K ：取决于荧光效率取决于荧光效率 f f根据根据Beer Law=10- clItI0F = K(I0 - I0 10- c l ) = KI0(1- 10- c l ) = KI0(1-

37、e2.303 c l )由于由于 ex =1+x+x2/2!+x3/3!+xn/n!所以所以 e-2.3 c l =1 - 2.3 cl + (-2.3 cl) 2/2!+ (-2.3 cl) 3/3!+e-2.3 c l =1 - 2.3 cl e-2.3 cl =1 - 2.3 cl 代入代入 F = KI0(1- e2.303 cl )F = KI0(1- 1+2.3 c l ) =2.3 K I0 l c 当荧光效率当荧光效率 f f 、入射光强度、入射光强度I0、物质的摩尔吸收系数物质的摩尔吸收系数 、液层厚度液层厚度b 均固定不变时，均固定不变时，荧光强度正比于该溶液的浓度荧光强度

38、正比于该溶液的浓度F = K c 荧光定量分荧光定量分析的依据析的依据 荧光强度可以在很弱的背景下被检测，荧光强度可以在很弱的背景下被检测，这完全取决于检测器的灵敏度，也是荧光分这完全取决于检测器的灵敏度，也是荧光分析方法灵敏度高的原因析方法灵敏度高的原因43二、定量分析方法二、定量分析方法1.1.标准曲线法标准曲线法 配制一系列标准浓度试样，测定荧光强度，绘制配制一系列标准浓度试样，测定荧光强度，绘制F-c的标的标准校正曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在准校正曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出试样的浓度标准曲线上求出试样的浓度2. 比较法比较法 在线性范

39、围内，测定标样和试样的荧光强度，比较之在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较之空白调空白调0，标品调，标品调100%或或50%44第三节第三节 荧光分光光度计荧光分光光度计四个部分四个部分激发光源、样品池、双单色器系统、检测器激发光源、样品池、双单色器系统、检测器特殊点特殊点有有两个单色器两个单色器，光源与检测器通常成，光源与检测器通常成直角直角单色器单色器：选择激发光波长的选择激发光波长的第一单色器和选择发射光第一单色器和选择发射光( (测测量量) )波长的第二单色器波长的第二单色器光源光源：氙灯、高压汞灯、激氙灯、高压汞灯、激光器光器( (可见与紫外区可见与紫外区) )检测器检测器：

40、光电倍增管光电倍增管45荧光光谱（荧光光谱（fluorecence spectrum）：）：固定激发固定激发光波长为最大激发波长光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。荧光物质的最大激发波长（荧光物质的最大激发波长（l lex）和最大）和最大发射波长发射波长（l lem）是鉴定物质的根据；也是定是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。量测定

41、最为灵敏的条件。4647荧光光谱的普遍特性荧光光谱的普遍特性1.斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift): 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值；荧光发；荧光发射波长总是大于激发光谱波长。射波长总是大于激发光谱波长。室温下菲的乙醇溶液荧光光谱室温下菲的乙醇溶液荧光光谱482.荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光重态的最低振动能级再跃迁

42、回到基态，从而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与激发波长无关。与激发波长无关。3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱的普遍特性荧光光谱的普遍特性激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。49nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激发光谱（虚线）蒽的激发光谱（虚线）荧光光谱（实线）荧光光谱（实线）蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4

43、E4E3E2E1E4E3E2E10S 1S50KtteFF 0fKeFeF 00/fKee /11 fKfK1 KtteFF /0fttFF 0ln二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构（一）荧光寿命和荧光效率（一）荧光寿命和荧光效率荧光寿命荧光寿命(fluorescence lift time)：当除去激发光当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，用所需的时间，用f表示。表示。以以tFF0ln对对t t作图，斜率即为作图，斜率即为f151吸收激发光的光子数发射荧光的光子数 f荧光效率荧光效率（fluorescence eff

44、iciency):指激发态指激发态分子发射荧光的分子数与基态分子吸收激发分子发射荧光的分子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用光的光子数之比，常用f表示。表示。荧光效率与物质的分子结构和所处的化学环境荧光效率与物质的分子结构和所处的化学环境条件有关。条件有关。52（二）有机化合物分子结构与荧光的关系（二）有机化合物分子结构与荧光的关系物质产生荧光必须具备的条件：物质产生荧光必须具备的条件：（1）物质的）物质的分子必须具有能够吸收紫外和较短分子必须具有能够吸收紫外和较短波长可见光的结构波长可见光的结构（2）物质）物质必须具有较大的荧光效率必须具有较大的荧光效率531.1.长共轭结构（芳香族化

45、合物）长共轭结构（芳香族化合物） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移emlf205nm278nm286nm321nm356nm404nm0.110.290.36exl542.2.分子的刚性分子的刚性分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧光长移。光长移。2 . 0 f0 . 1 f553.3.取代基取代基给电子基团使荧光增强；荧光波长长移。给电子基团使荧光增强；荧光波长长移。吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。同同 电

46、子体系相互作用小的取代基对荧光影响电子体系相互作用小的取代基对荧光影响不明显。不明显。56（三）荧光试剂（三）荧光试剂1.1.荧光胺荧光胺nm390275、 exlnmem455 lnm340 exl2.2.邻苯二甲醛邻苯二甲醛( (OPA) )nmem480 lnm365 exlnmem500 l3.1-3.1-二甲氨基二甲氨基5 5氯化磺酰萘氯化磺酰萘4.4.测定无机离子的荧光试剂测定无机离子的荧光试剂57三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素温度增加，荧光效率和荧光强度下降。温度增加，荧光效率和荧光强度下降。1.温度温度2.溶剂溶剂*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也

47、跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低。发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低。583.酸度酸度NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+pH 34pH 6759荧光猝灭：荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂分子或其他荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。象称为荧光猝灭。荧光熄灭剂：荧光熄灭剂：能引起荧光强度降低的物质。能引起荧光强度降低的物质。4.荧光熄灭剂荧光熄灭剂碰撞猝灭碰撞猝灭 M+hvM*,M*+Q M+热热静态猝灭静态猝灭 M+Q MQ 非荧光物质非荧光物质转入三重态的猝灭转

48、入三重态的猝灭 三重态三重态荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭 荧光物质浓度较高荧光物质浓度较高导致荧光熄灭的原因：导致荧光熄灭的原因：60荧光熄灭法荧光熄灭法: : 荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄灭法。灭法。5.5.散射光散射光瑞利光：瑞利光：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，运动方向改变；能量交换，运动方向改变；瑞利光瑞利光入射光入射光拉曼光：拉曼光：光

49、子与物质分子发生非弹性碰撞，发光子与物质分子发生非弹性碰撞，发生生能量交换，运动方向改变；能量交换，运动方向改变；拉曼光拉曼光入射光入射光61320360448激发激发 320nm硫酸奎宁硫酸奎宁350448激发激发 350nm硫酸奎宁硫酸奎宁320360激发激发 320nm0.1mol/L硫酸硫酸350400激发激发 350nm0.1mol/L硫酸硫酸a.强度强度b.强度强度硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（a）与拉曼光谱（）与拉曼光谱（b）62溶剂溶剂激发光激发光(nm) 248 313 365 405 436水水乙乙 醇醇环己烷环己烷CCl4CHCl3271

50、 350 416 469 511267 344 409 459 500267 344 408 458 499 320 375 418 450 346 410 461 502在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长( (nm) )63第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系I0IF)(0IIKFEClII100)1 ()101 (3 . 200EClECleIKIKF)! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(! 1)3 . 2(1 (1 320 EClEClEClIKF! 3)3 . 2(! 2)3