高效液相色谱法 现代食品检测技术 教学课件.ppt

1、第一节第一节 概述概述 高效液相色谱法：高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法5一、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实

2、质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 根据分离机制不同，液相色谱可分为，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，

3、占有机物的80%续前2流动相差别流动相差别 GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性3操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长

4、 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径4 倍则更加保险倍数进 样进 样 量全定量环进样全定量环进样准确，但浪费样品至少需要2.5倍进样体积的样品部分定量环进样部分定量环进样进样量 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)。第五节 高效液相色谱法分类 一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（BPC） 四、离子交换色谱法 五、凝胶色谱法80一、液固色谱法 原理：原理： 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）

5、。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下： Xm + nSa = Xa + nSm 式中：Xm-流动相中的溶质分子；Sa-固定相中的溶剂分子；Xa-固定相中的溶质分子；Sm-流动相中的溶剂分子。 当吸附竞争反应达平衡时： K=XaSm/XmSa 式中：K为吸附平衡常数。81一、液固色谱法固定相一、液固色谱法固定相 液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质性质可分为极性和非极极性和非极性性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子

6、筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。 各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体82液液-固吸附色谱流动相固吸附色谱流动相 液相色谱的流动相必须符合下列要求： （1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。 （2）与固定相不互

7、溶，也不发生不可逆反应。 （3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。 （4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。 （5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便 宜等。在液-固色谱中，选择流动相的基本原则基本原则是 极性大的试样用极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。83二、液液色谱法 液液色谱又称液液分配色谱。原理：原理： 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

8、式中，cs溶质在固定相中浓度；cm-溶质在流动相中的浓度； Vs固定相的体积；Vm流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。84一、固定相一、固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30 40m的实心玻璃球和厚度约为1 2 m的多孔性外层所组成。（2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30 50 m的多孔型颗粒。（3）全多孔型微粒载体全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。

9、这种载体粒度为5 10 m。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。 由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如如 ， 氧二丙腈氧二丙腈（ODPN），），聚乙二醇（聚乙二醇（PEG），），十八烷（十八烷（ODS）和角鲨烷固和角鲨烷固定液等。定液等。 二、流动相二、流动相 在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两因此固定液和流动相的性质往往处于两 个个极端极端，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或

10、非极性溶剂。a. 正相液液分配色谱法：流动相的极性小于固定液的极性。b. 反相液液分配色谱法：流动相的极性大于固定液的极性。 以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为正相分配色谱正相分配色谱，适合于分离极性化合物； 反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配色谱反相分配色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。86三、化学键合相色谱 70年代初发展了一种新型的固定相化学键合固定相。这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上（载体）表面的游离羟基上，代替机械

11、涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。键合固定相OHOHOHOOO+ C18H37SiCl3SiC18H37非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HP

12、LC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。ODS（Octa Decyltrichloro Silane)一、化学键合固定相一、化学键合固定相 化学键合固定相一般都采用硅胶硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或

13、有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型：（1）硅酸酯型（）硅酸酯型（=Si-O-C）键合相键合相 将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。（2）硅氮型（）硅氮型（=Si-N）键合相键合相 如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。（3）硅碳型（）硅碳型（=Si-C）键合相键合相 将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。（

14、4）硅氧烷型（）硅氧烷型（=Si-O-Si-C）键合相键合相 将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。二、反相键合相色谱法二、反相键合相色谱法 在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称O D S或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。 目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱分配色谱，另一种认为属于吸附色谱吸附色谱。 在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出

15、，极性小的组分后流出。流出。三、正相键合色谱法三、正相键合色谱法 在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而键合相的名称由键合上去的基团而定定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。常用于分离极性化合物。一

16、般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱分配色谱。组分的分配比K值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。 该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。四、离子性键合相色谱法四、离子性键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质化学生成各种离子交换基团如-SO3H , -CH2NH2 , -COOH 等时，形成了所谓的离子性键合色谱。其分离原理与离子交换色谱一样，只是填料是一种新型的离子交换剂而已。SO3H + M+ SO3M + H+ 化学键合色谱具有下列优点：化学键合色谱具有下

17、列优点：（1）适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以 通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。（2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。（3）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。（4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。四、离子交换色谱法 离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生

18、成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。一、固定相一、固定相 离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式：一是常见的纯离子交换树脂；：一是常见的纯离子交换树脂；第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂；第三种为大孔径网络型树脂离子交换树脂；第三种为大孔径网络型树脂。 典型的离子交换树脂是由苯乙烯苯乙烯和二乙烯苯交联共聚二乙烯苯交联共聚而成。 按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和按结合的基团不同，离子交换树

19、脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阴离子交换树脂。 阳离子交换树脂上具有与阳离子交换的基团。阳离子交换树阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂脂又可分为强酸性和弱酸性树脂。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为-SO3-H+ ，其中-SO3-和有机聚合物牢固结合形成固定部分，H+是可流动的能为其它阳离子所交换的离子。 阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。二、流动相二、流动相 离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。 五、排阻色谱法 排阻色谱法也称空间排

20、阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。 排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶填料是凝胶 尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。分子质量的分布。 排阻色谱的固定相一般可分为 软性、半刚性和刚性凝胶软性、半刚性和刚性凝胶 三类。 所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。（1）软性凝胶软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。（2）半刚性凝胶半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作流动相。（3）刚性凝胶刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。