（生物化学教学课件）第20章 重组dna技术(5-1, lmj2015) (1).ppt

1、第二十章第二十章重组重组DNADNA技术技术Recombinant DNA technique 第一节第一节 重组重组DNADNA技术的基本过程技术的基本过程Basic Process of Recombinant DNA Technology 2022年年5月月21日日6时时54分分2学习要求：学习要求： 掌握掌握重组重组DNA技术与基因工程的概念、基本原技术与基因工程的概念、基本原理和基本步骤。理和基本步骤。又称又称基因工程基因工程，是是在体外将不同来源的在体外将不同来源的或或 插入插入，构建成，构建成并将它导入到合适的并将它导入到合适的，使其在细胞中扩增和繁殖，使其在细胞中扩增和繁殖，；

2、再进行扩增、；再进行扩增、。2022年年5月月21日日6时时54分分3 亦称亦称，或或。 获取这类同一的获取这类同一的DNADNA分子群体、细胞群体或个体分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。群体的过程，即无性繁殖。 又称又称嵌合嵌合DNADNA（chimera DNAchimera DNA），），是采用克隆技术是采用克隆技术把来自不同生物的把来自不同生物的外源外源 DNADNA插入插入载体分子载体分子所形成的杂所形成的杂合合DNADNA分子。分子。2022年年5月月21日日6时时54分分4 指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的上同

3、一的DNADNA分子、细胞或个体；分子、细胞或个体；2022年年5月月21日日6时时54分分52022年年5月月21日日6时时54分分62022年年5月月21日日6时时54分分72022年年5月月21日日6时时54分分8Common Enzymes Used in Recombinant DNA Technology学习要求：学习要求： 掌握掌握限制性内切酶的概念、性质和分类方法，限制性内切酶的概念、性质和分类方法，熟悉熟悉重组技术中的其他工具酶。重组技术中的其他工具酶。 是一类能识别双链是一类能识别双链DNADNA中的某些中的某些，并由此切割，并由此切割DNADNA双链的核酸内切酶，又称为双

4、链的核酸内切酶，又称为与与共同构成细菌的共同构成细菌的，限，限制外源制外源DNADNA，保护自身，保护自身DNADNA。2022年年5月月21日日6时时54分分9 主要是从原核生物中分离纯化而来。主要是从原核生物中分离纯化而来。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。H Hinind d 属属 种种 株株 序序Haemophilus Haemophilus in

5、influenzae fluenzae d d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 d d株的第三种酶株的第三种酶2022年年5月月21日日6时时54分分10和和型限制酶通常是相对型限制酶通常是相对反应过程中反应过程中需有需有MgMg2+2+和和ATPATP参与参与。、和和型（基因工程技术中常用型（基因工程技术中常用型）。型）。型限制酶型限制酶通常以通常以同源二聚体同源二聚体形式存在，形式存在，只具只具有核酸内切酶活性有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中而无甲基化酶活性，反应过程中只需有只需有MgMg2+2+参与参与而不需有而不需有ATPATP参与。参与。2022年年5月月21日日6时时54分

6、分11 类酶识别序具有类酶识别序具有回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)特点，特点， 即具有即具有双重旋转对称结构双重旋转对称结构的的DNADNA反向重复双链序列反向重复双链序列。型型 大部分大部分型限制酶都能识别由型限制酶都能识别由4 48 8个核苷酸组个核苷酸组成的特定序列。成的特定序列。2022年年5月月21日日6时时54分分12Bam Bam HHGGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGGTCGTCCAGCAGGACGACCTGCTG平端切口平端切口G GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G G粘端切口粘端切口HinHinddGTCGACGT

7、CGACCAGCTGCAGCTG平或钝末端（平或钝末端（blunt end)blunt end)粘性末端（粘性末端（sticky end)sticky end)2022年年5月月21日日6时时54分分13GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst 来源不同但能识别相同序列，切割来源不同但能识别相同序列，切割 DNADNA后产生后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶功异源酶。2022年年5月月21日日6时时54分分14 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG

8、GATCC GATCTAG GATCT A 识别序列不完全相同，但切割识别序列不完全相同，但切割 DNADNA后，产生相同的黏后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端配伍未端(compatible end)(compatible end)。2022年年5月月21日日6时时54分分15 识别识别DNADNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过识别序列往往超过6 6个核苷酸。为个核苷酸。为型限制酶的特例。型限制酶的特例。 Bstp GGTNACC CCANTGG2

9、022年年5月月21日日6时时54分分16 Bbl CGGN(N)4CCG; GCC(N)4NGGC 重组重组DNADNA技术、基因组技术、基因组DNADNA物理图谱绘制、基因组物理图谱绘制、基因组DNADNA同源性研究、切割基因组同源性研究、切割基因组DNADNA或或cDNAcDNA构建基因组文构建基因组文库或库或cDNAcDNA文库等。文库等。 DNADNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。时间及缓冲液体系等。2022年年5月月21日日6时时54分分17 只能封闭只能封闭DNADNA链上的链上的缺口（缺口（nicknick）

10、, ,而不能封闭而不能封闭裂口（裂口（gapgap）。）。 需要在一条需要在一条DNADNA链的链的3 3 末端具有游离的羟基末端具有游离的羟基、另、另一条一条DNADNA链的链的5 5 末端有磷酸基团末端有磷酸基团，而且反应过程需要，而且反应过程需要由由ATPATP提供能量。提供能量。2022年年5月月21日日6时时54分分18 只能连接具有互补只能连接具有互补黏性末端黏性末端的两个双链的两个双链DNADNA分分子底物。需要子底物。需要NADNAD+ +作为辅助因子。作为辅助因子。2022年年5月月21日日6时时54分分19*GAATTC*CTTAAG*5353EcoR IDNA连接酶连接酶

11、*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OH+*AGCT*TCGA*5353Alu IT4 DNA连接酶连接酶OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*+2022年年5月月21日日6时时54分分20 连接的底物可以是两个双链连接的底物可以是两个双链DNADNA分子的互补分子的互补黏黏性末端性末端或或平末端平末端。最早是从。最早是从T4T4噬菌体感染的大肠埃噬菌体感染的大肠埃希菌分离，易制备，应用广。希菌分离，易制备，应用广。2022年年5月月21日日6时时54分分212022年年5月月21日日6时时54分分22 能够催化以能够催化以DNA

12、DNA或或RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA的反应，的反应，把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNADNA分子或引分子或引物链的物链的3 3 -OH-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。末端，催化核苷酸的聚合作用。 具有具有 具有具有2022年年5月月21日日6时时54分分23依赖依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。是最常用的高保真是最常用的高保真DNA聚合酶聚合酶之一。之一。有有活性活性 是被发现的第一个耐热的、依是被发现的第一个耐热的、依赖赖DNADNA的的DNADNA聚合酶，聚合酶，有有活性活性活性活性对对MgMg2+2+浓度非常敏感。浓度

13、非常敏感。 普遍使用的是来源于普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血鸟类成髓细胞白血病病毒病病毒)及及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录的反转录酶，酶，具有具有2022年年5月月21日日6时时54分分24 （terminal deoxynucleotidyl transferaseterminal deoxynucleotidyl transferase） (1) (1) 底物是底物是或有或有。5533OHCo2+dNTPnppi5533( (A/G/C/T)n)n2022年年5月月21日日6时时54分分25(2) (2) 底物是底物是或或的双链的双链DNADNA。

14、Co2+dNTPnppi53OH53(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi53OH53(A/G/C/T)n （1 1）主要作用是在载体或目的）主要作用是在载体或目的基因基因 3 3 末端加上末端加上同源多聚尾巴同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于，形成人工黏性末端，便于DNADNA重组。重组。 （2 2）DNA 3DNA 3 末端的同位素标记末端的同位素标记。2022年年5月月21日日6时时54分分26 （alkaline phosphatasealkaline phosphatase） 能特异地切除能特异地切除DNADNA和和RNARNA上上5 5 - -磷酸基团磷酸基团。 （poly

15、nuleotide kinasepolynuleotide kinase） 又称又称T4T4多核苷酸激酶，能催化多核苷酸激酶，能催化ATPATP的的- -磷酸基磷酸基团转移到团转移到DNADNA或或RNARNA片段的片段的5 5 -OH-OH末端末端。2022年年5月月21日日6时时54分分27重组重组DNADNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶Common Vectors in Recombinant DNA Technology2022年年5月月21日日6时时54分分29学习要求：学习要求：掌握质粒载体的概念和特点，掌握质粒载体的概念和特点，了解了解各载体的应各载体的应用。用。 是在克

16、隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适应的适应的强启动子强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。或纯化的元件。复制起始点复制起始点oriCoriC，2022年年5月月21日日6时时54分分30复制起始点，复制起始点，2022年年5月月21日日6时时54分分31最常用的目的基因最常用的目的基因用于克隆大片段用于克隆大片段DNADNA( (自习自习) )用于用于SangerSanger双脱氧双脱氧DNADNA测序测序( (自习自习) )构建基因组构建基因组DNADNA或或cDNAcDNA文库文库( (自习自习) )包括

17、人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病 毒用于在真核细胞中表达目的蛋白毒用于在真核细胞中表达目的蛋白( (自习自习) )用于更大用于更大DNADNA片段的克隆片段的克隆( (自习自习) )2022年年5月月21日日6时时54分分32细菌培养细菌培养染色质染色质质粒质粒 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plaxmidstringent plaxmid） 松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plaxmidrelaxed plaxmid）AmprORITetr两个抗性基因，用两个抗性基因，用于筛选阳性克隆。于筛选阳性克隆。两个酶切位点，用两个酶切位点，用于插

18、入目的基因于插入目的基因复制起始点，保证复制起始点，保证高拷贝自我复制高拷贝自我复制。2022年年5月月21日日6时时54分分34OripUC192686 bpAmprP(BLA)PlacAva I (413)BamHI (418)Eco RI (397)Hin dIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCS提供多个单酶提供多个单酶切位点用于克切位点用于克隆操作隆操作Lac Z半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端端肽片段肽片段的编码基因的编码基因2022年年5月月21日日6时时54

19、分分351.1.能在体外转录克隆基因的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体 由由pUCpUC系列质粒载体派生而来，系列质粒载体派生而来，带有来自噬菌体带有来自噬菌体T7T7、SP6SP6的启动子的启动子，为，为RNARNA聚合酶的附着提供了特异聚合酶的附着提供了特异性识别位点。如性识别位点。如pGEM-3Z/4Z.pGEM-3Z/4Z.2.2.穿梭质粒载体穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectorshuttle plasmid vector） 是一类人工构建的，是一类人工构建的，具有具有两种不同复制起始点两种不同复制起始点和选择标记和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复

20、，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。制的质粒载体。2022年年5月月21日日6时时54分分36 许多耐热的许多耐热的DNADNA聚合酶聚合酶( (如如等等) )扩增时，扩增时，都在都在PCRPCR产物产物3 3 - -末端加上了末端加上了A A碱基。碱基。335PCR产物产物AA5Taq酶酶T载体载体TT55332022年年5月月21日日6时时54分分37在连接酶的作用下可直接将在连接酶的作用下可直接将PCRPCR产物克隆到产物克隆到TATA载体中。载体中。 可容纳可容纳7 kb7 kb以下以下的外源片段。有供外源基因片的外源片段。有供外源基因片段插入的单一内切酶位点。段插入的单一

21、内切酶位点。 可容纳可容纳9 923kb23kb的外源片段。有两个或两组内切的外源片段。有两个或两组内切酶位点，供外源基因片段插入替代。酶位点，供外源基因片段插入替代。2022年年5月月21日日6时时54分分38（自习）（自习）（自习）（自习） ，简称，简称YACYAC载体载体，由酵母染，由酵母染色体、酵母色体、酵母2 2mDNAmDNA质粒的复制起始序列等元件衍生质粒的复制起始序列等元件衍生而成；可插入而成；可插入100kb100kb2,000kb2,000kb外源外源DNADNA片段，是人类片段，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。 ，简称

22、，简称BACBAC载体载体，以细菌，以细菌F F因因子为基础构建而成；可插入子为基础构建而成；可插入100kb100kb300kb300kb外源外源DNADNA片片段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。2022年年5月月21日日6时时54分分39逆转录病毒逆转录病毒(retrovirus, RV )(retrovirus, RV )慢病毒慢病毒(lentivirus):(lentivirus):也属于也属于RVRV家族家族腺病毒腺病毒(adenovirus,Ad)(adenovirus,Ad)腺相关病毒腺相关病毒(adeno-associa

23、ted virus,AAV)(adeno-associated virus,AAV)单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV) (herpes simplex virus,HSV) 埃埃- -巴二氏病毒巴二氏病毒 (Epstein-Barr virus,EBV)(Epstein-Barr virus,EBV)痘苗病毒痘苗病毒(vaccinia virus)(vaccinia virus)（自习）（自习）2022年年5月月21日日6时时54分分40第四节第四节目的基因的获得和体外重组目的基因的获得和体外重组Target DNA Acquirement & Rec

24、ombinant In Vitro2022年年5月月21日日6时时54分分41学习要求：学习要求：熟悉熟悉目的基因的获取方法、重组目的基因的获取方法、重组DNA分子的构建。分子的构建。* 已知氨基酸序列推测可能的已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。2022年年5月月21日日6时时54分分42* 避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。反反转转录录AAnATTnT 55mRNA反转录酶反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶核糖核酸酶HTTnT3cDNA核酸酶核酸酶S1双链双链cDNA35 35 5加热变性加热变性加入加入特异性引物特

25、异性引物DNA聚合酶聚合酶重复上述步骤重复上述步骤扩增出大量的产物扩增出大量的产物聚聚合合酶酶链链式式反反应应退火退火延伸延伸gDNA文库：文库：g-文库文库cDNA文库：文库：c-文库文库方法：方法： 用 目 的 基 因用 目 的 基 因上的一段上的一段DNADNA做成做成探针与文库中的探针与文库中的DNADNA作核酸杂交，作核酸杂交，从 基 因 文 库 中从 基 因 文 库 中“钓出钓出”有目的有目的基因的克隆。基因的克隆。2022年年5月月21日日6时时54分分44Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶，连接酶，15C目的基因用目的基因用 Bam H切割

26、切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因目的基因自连自连载体载体自连自连GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGE

27、coR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶，连接酶，15C重组体重组体2022年年5月月21日日6时时54分分46目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连连接酶，接酶，15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连2022年年5月月21日日6时时54分分47Eco RCCGAATTCG GGCTTAAGC5 -3 -Eco R由平端加由平端加上新的酶切位上新的酶切位点，再用限制点，再用限制酶切除产生粘酶切除产生粘性末端，而进性末端，而进行粘端连接行

28、粘端连接。 2022年年5月月21日日6时时54分分485 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 T(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nT重组体重组体3 A(A)nA A(A)nA3 5 5 2022年年5月月21日日6时时54分分49PCR扩增扩增+335PCR产物产物AA5T载体载体TT5533蓝白筛选蓝白筛选Taq酶酶2022年年5月月21日日6时时54分分502022年年5月月21日日6时时54分分51Inporting, Screen

29、ing & Verification of Recombinant DNA学习要求：学习要求：熟悉熟悉重组重组DNA分子引入宿主细胞、筛选以及一分子引入宿主细胞、筛选以及一些常用的分子生物学技术检测。些常用的分子生物学技术检测。 处于感受态处于感受态 对载体无严格限制对载体无严格限制 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 不对外源不对外源DNADNA进行修饰进行修饰 能表达重组体所提供表型特征能表达重组体所提供表型特征 将体外构建的重组将体外构建的重组DNADNA分子导入用于复制、分子导入用于复制、扩增和表达的扩增和表达的原核或真核受体细胞原核或真核受体细胞。2022年年5月月21日日6时时5

30、4分分52 指将质粒指将质粒DNADNA或以质粒为载体构建的重组或以质粒为载体构建的重组DNADNA导入导入细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌K12K12突变株经突变株经低渗低渗CaClCaCl2 2,0,0处理处理进入感受态。进入感受态。DHDH5 5 指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA DNA 分子导入真核细胞的过程。分子导入真核细胞的过程。 指以噬菌体或病毒载体构建的重组指以噬菌体或病毒载体构建的重组DNADNA，经体外，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，通过感染包装成具有感染性的噬菌体或病毒

31、颗粒后，通过感染宿主细胞而将重组宿主细胞而将重组DNADNA注入细菌或真核细胞的过程。注入细菌或真核细胞的过程。2022年年5月月21日日6时时54分分531.1.磷酸钙介导的转染磷酸钙介导的转染2.DEAE-2.DEAE-葡聚糖介导的转染葡聚糖介导的转染2022年年5月月21日日6时时54分分54非转化细胞非转化细胞( (不能生长）不能生长）自身环化载体自身环化载体酶解未完全载体酶解未完全载体2022年年5月月21日日6时时54分分55DNA连接酶连接酶重组质粒重组质粒 目的基因与目的基因与pBR322经经BamH I酶切后进行重组酶切后进行重组2022年年5月月21日日6时时54分分56A

32、mprTetrPst I1 2 3 45 6 7 8910 1112AmpTetTet平板平板1 2 3 45 6 7 8910 1112目的基因目的基因用用BamH I酶切酶切A typical bacterial transformation experiment.BamH I切割目标基因切割目标基因。2022年年5月月21日日6时时54分分585-溴溴-4-氯氯-3-吲哚半乳糖苷吲哚半乳糖苷(X-gal)2022年年5月月21日日6时时54分分59蓝色菌落：阴性克隆蓝色菌落：阴性克隆; 白色菌落：阳性克隆白色菌落：阳性克隆 2022年年5月月21日日6时时54分分60组氨酸缺陷型组氨酸缺

33、陷型大肠杆菌大肠杆菌无组氨酸的培养基无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶酸脱水酶促进组氨酸合成促进组氨酸合成 DNADNA重组体重组体标志补救标志补救2022年年5月月21日日6时时54分分61 是从基因文库中挑选含有目的基因的阳性克隆是从基因文库中挑选含有目的基因的阳性克隆的常用方法。的常用方法。 根据根据MCSMCS两侧的保守序列设计引物，对提取的重两侧的保守序列设计引物，对提取的重组载体进行组载体进行PCRPCR扩增鉴定，并可直接进行测序。扩增鉴定，并可直接进行测序。2022年年5月月21日日6时时54分分62 利用特异性抗体与目的基因表达的蛋白质相互利用特异性抗体与目的

34、基因表达的蛋白质相互结合结合通过放射免疫、化学发光通过放射免疫、化学发光来筛选转化菌。来筛选转化菌。 用插入点的限制酶酶切重组用插入点的限制酶酶切重组DNADNA，行琼脂糖凝胶，行琼脂糖凝胶电泳，观察目的基因和载体的泳带是否存在。电泳，观察目的基因和载体的泳带是否存在。目的基因目的基因( (外源基因）外源基因）gDNA文库文库 cDNA文库文库化学合成化学合成RT-PCR连接酶连接酶转化转化 、转染、感染、转染、感染筛选筛选2022年年5月月21日日6时时54分分63质粒质粒噬菌体噬菌体 病毒病毒人工人工染色体染色体限制酶消化限制酶消化2022年年5月月21日日6时时54分分64Exogeno

35、us Gene Expression第六节第六节学习要求：学习要求：了解外源基因的表达了解外源基因的表达 。外源基因的表达外源基因的表达的建立包括的建立包括技术技术和策略：和策略： 涉及目的基因的涉及目的基因的克隆、扩增克隆、扩增，转转录、翻译录、翻译，蛋白质产物的加工修饰蛋白质产物的加工修饰，以及，以及分离、纯分离、纯化化等过程，需要在适合的等过程，需要在适合的表达系统表达系统中完成。中完成。 表达系统可根据受体细胞的不同分为表达系统可根据受体细胞的不同分为和和。2022年年5月月21日日6时时54分分65 表达载体表达载体的构建；的构建； 受体细胞受体细胞的建立及的建立及表达载体的导入和表

36、达表达载体的导入和表达； 表达产物的分离、纯化等表达产物的分离、纯化等。 外源真核基因不能带有外源真核基因不能带有5 5 端非编码区和内含子结端非编码区和内含子结 构构，必须用，必须用cDNAcDNA或化学合成基因或化学合成基因； 外源基因必须置于原核细胞的外源基因必须置于原核细胞的强启动子强启动子和和SDSD序列序列 等元件控制下；等元件控制下； 重组载体必须形成重组载体必须形成； 外源基因转录生成的外源基因转录生成的mRNAmRNA必须相对稳定并能被有必须相对稳定并能被有 效翻译效翻译，所表达的，所表达的蛋白质产物稳定且对宿主菌不蛋白质产物稳定且对宿主菌不 能有毒害作用能有毒害作用。202

37、2年年5月月21日日6时时54分分66MCSMCS的上下游分别的上下游分别和和， 与插入的目的基因组与插入的目的基因组成转录成转录单位。单位。 MCSMCS的上下游分别的上下游分别， 与插入的目的基因组与插入的目的基因组成翻译模板成翻译模板。2022年年5月月21日日6时时54分分67 是是在克隆载体的基础上在克隆载体的基础上，加上可使插入，加上可使插入基因在基因在宿主细胞中表达所需的必要元件宿主细胞中表达所需的必要元件，如，如启动子启动子、终止终止子子、核糖体识别位点、起始密码和终止密码核糖体识别位点、起始密码和终止密码等。等。UU2022年年5月月21日日6时时54分分68DNA聚合酶聚合

38、酶RNA聚合酶聚合酶核糖体核糖体核糖体核糖体融合型表达蛋白融合型表达蛋白非融合型表达非融合型表达 外源目的基因不与其他基因融合，外源目的基因不与其他基因融合， 直接从起始密码直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制下开始在原核调控元件控制下 表达蛋白质。表达蛋白质。分泌型表达分泌型表达包含体包含体(inclusion body)(inclusion body)蛋白质致密蛋白质致密地集聚在细胞内地集聚在细胞内水不溶性水不溶性2022年年5月月21日日6时时54分分69优点优点: :2022年年5月月21日日6时时54分分70培养简单、迅速、经济而又适合大规模生产。培养简单、迅速、经济而又适合大

39、规模生产。 缺点缺点: :2022年年5月月21日日6时时54分分71 尤其是用于酵母表达系统的表达载体，大尤其是用于酵母表达系统的表达载体，大多是穿梭载体。多是穿梭载体。2022年年5月月21日日6时时54分分72 病毒感染（天然方法病毒感染（天然方法 ） 载体转染（化学或物理方法载体转染（化学或物理方法 ） 系统系统 胸苷激酶基因胸苷激酶基因HATHAT选择选择系统系统 二氢叶酸还原酶基因选择二氢叶酸还原酶基因选择系统系统 2022年年5月月21日日6时时54分分73 瞬时表达宿主细胞瞬时表达宿主细胞常用来源于非洲绿猴肾常用来源于非洲绿猴肾CV-1CV-1细胞株的细胞株的COSCOS细胞细

40、胞；稳定表达宿主细胞稳定表达宿主细胞常用来源于中国仓鼠卵巢的常用来源于中国仓鼠卵巢的CHOCHO细胞；细胞；2022年年5月月21日日6时时54分分742022年年5月月21日日6时时54分分75第七节第七节重组重组DNADNA技术的应用技术的应用Application of recombinant DNA technique 自习自习学习要求：学习要求：了解重组了解重组DNA技术的应用。技术的应用。重组重组DNADNA技术的主要应用技术的主要应用 (1) 克隆目的基因，研究疾病相关基因的结构与克隆目的基因，研究疾病相关基因的结构与功能，分析疾病发病的分子机制；功能，分析疾病发病的分子机制；

41、(4) 利用定点突变技术，研究蛋白质的结构与功利用定点突变技术，研究蛋白质的结构与功能，或对蛋白质进行结构改造；能，或对蛋白质进行结构改造； (5) 开发基因工程药物与疫苗用于疾病治疗。开发基因工程药物与疫苗用于疾病治疗。 (2) 利用转基因技术和基因剔除技术研究基因功利用转基因技术和基因剔除技术研究基因功能，建立转基因动物模型；能，建立转基因动物模型； (3) 建立基因鉴定、诊断与基因治疗的新方法；建立基因鉴定、诊断与基因治疗的新方法；生长素生长素治疗治疗侏儒症侏儒症胰岛素胰岛素促治疗糖尿病促治疗糖尿病颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红

42、细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII进凝血进凝血超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗肿瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱 重组重组DNADNA医药产品医药产品