紫外-课件分光光度法的拓展.ppt

1、紫外紫外- -可见分光光度法的扩展可见分光光度法的扩展Extension of UV / VisSpectrophotometry紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 定性分析定性分析( (一一) )定性鉴别定性鉴别1 1 对比吸收光谱特征数据对比吸收光谱特征数据 如如 maxmax及及 (E)(E)2 2 对比吸收度对比吸收度( (或吸收系数或吸收系数) )的比值的比值 如如 A A1 1/A/A2 2( (或或E E1 1/E/E2 2) )3 3 对比吸收光谱的一致性对比吸收光谱的一致性( (二二) )纯度检查纯度检查1 1 杂质检查杂质检查 如乙醇或环己烷中少量苯如乙醇或环己烷中

2、少量苯2 2 杂质限量检查杂质限量检查 如肾上腺素中肾上腺酮等如肾上腺素中肾上腺酮等 maxmax E E安宫黄体酮安宫黄体酮 240 2401 1nm 408nm 408 炔诺酮炔诺酮 240 2401 1nm 571 nm 571 VBVB12 12 E E (361nm)(361nm)E E (278nm)(278nm)=1.70-1.88=1.70-1.88E E (361nm)(361nm)E E (550nm)(550nm)=3.15-3.45=3.15-3.451cm1%1cm1%1cm1%1cm1%1cm1%A A 否定性鉴别！否定性鉴别！ 红外光谱法是肯定性红外光谱法是肯定性

3、鉴别方法，那么，作为否鉴别方法，那么，作为否定性鉴别方法的紫外光谱定性鉴别方法的紫外光谱法，是否在定性分析中用法，是否在定性分析中用处不大呢？处不大呢？No!Wavenumber (cm-1)TransmittanceAbsorbanceWavelength (nm)UV/VisIRA A 糯米、梗米、油、水、糖、豆沙糯米、梗米、油、水、糖、豆沙 糯米、梗米、油、水、酱油、蛋黄糯米、梗米、油、水、酱油、蛋黄 糯米、梗米、油、水、酱油、肉糯米、梗米、油、水、酱油、肉 + +0 0- -+ +0 0- -+ +0 0- -+ +0 0- -+ +0 0- -+ +0 0- -. . . . . .

4、 .图、安钠咖图、安钠咖注射液（含苯注射液（含苯甲酸钠和咖啡因甲酸钠和咖啡因二个组分）通过变二个组分）通过变换得到的褶合光谱群换得到的褶合光谱群Convolution spectra of caffeine, these figure shows 164 convolution curves of 2-30 points200220240260280300051015202530-0.45-0.4-0.35-0.3-0.25-0.2-0.15-0.1-0.0500.05wavelengthQ1 of caffeineNjQij褶合光谱法定性分析功能褶合光谱法定性分析功能( (一一) )定性鉴别

5、定性鉴别( (二二) )纯度（杂质限量）检查纯度（杂质限量）检查( (三三) )稳定性试验稳定性试验丙酸倍氯米松丙酸倍氯米松- -倍他米松紫外光谱图倍他米松紫外光谱图AmaxAminAmaxAmin00.050.10.150.20.250.30.350.4220240260280300051015202530200210220230240250260270280290300-0.45-0.4-0.35-0.3-0.25-0.2-0.15-0.1-0.0500.05Q1 of ceuf0Qij丙酸倍氯米松丙酸倍氯米松- -倍他米松褶合光谱差谱图倍他米松褶合光谱差谱图 ( (差谱比率差谱比率55.

6、70%)55.70%)Qj=1 j=2 j=3n=2-30 n=3-30 n=4-30倍他米松倍他米松- -地塞米松结构图地塞米松结构图OCH3FHOHHCH3COCH2OHOHRR:CH3R:CH3倍他米松地塞米松R倍他米松倍他米松- -地塞米松紫外光谱图地塞米松紫外光谱图00.10.20.30.40.50.60.7220240260280300AmaxAminAmaxAmin倍他米松倍他米松- -地塞米松褶合光谱差谱图地塞米松褶合光谱差谱图 ( (差谱比率差谱比率13.36%)13.36%)Qj=1 j=2 j=3n=2-30 n=3-30 n=4-30紫外紫外- -可见分光光度法可见分光

7、光度法 定量分析定量分析 测定样品测定样品 A AX X c cX X( (三三) )含量测定含量测定（定量灵敏度（定量灵敏度1010-6-6 1010-7-7g/mlg/ml）1 1 单组分定量单组分定量(1)(1)吸收系数法吸收系数法( (绝对法绝对法) ) c=A/Elc=A/El(2)(2)标准曲线法标准曲线法 标准溶液标准溶液 c c1 1,c,c2 2,c,c3 3,c,c4 4,c,c5 5 测定吸收度值测定吸收度值 A A1 1,A,A2 2,A,A3 3,A,A4 4,A,A5 5 (3)(3)对照法对照法 同条件配制同条件配制 c c标标,c,c样样 同条件测定同条件测定

8、A A标标,A,A样样 c c样样= = c c标标A A样样 / / A A标标2 2 多组分定量多组分定量两组分光谱互不重叠两组分光谱互不重叠 2 2 1 1a ab bA A寻找寻找 1 1, , 2 2互不干扰，作单组分处理互不干扰，作单组分处理 两组分光谱部分重叠两组分光谱部分重叠a ab bA A 1 1 2 2寻找寻找 1 1, , 2 2，一处不干扰，另一处用，一处不干扰，另一处用A=AA=A1 1+A+A2 2加和处理加和处理 两组分光谱完全重叠两组分光谱完全重叠A Ab ba a 2 2 1 1(1)(1)解线性方程组法解线性方程组法A A1 1a+ba+b=A=A1 1a

9、 a+A+A1 1b b=E=E1 1a aC Ca a+E+E1 1b bC Cb bA A2 2a+ba+b=A=A2 2a a+A+A2 2b b=E=E2 2a aC Ca a+E+E2 2b bC Cb b (2)(2)双波长分光光度法双波长分光光度法a.a.等吸收双波长消去法等吸收双波长消去法 1 2 Aab A Aa a+b+b=A=A2 2a+ba+b-A-A1 1a+ba+b=A=A2 2a a+A+A2 2b b-A-A1 1a a-A-A1 1b b=A=A2 2b b-A-A1 1b b=(E=(E2 2b b-E-E1 1b b) )C Cb b A A A Ax+y

10、x+y= =kAkA2 2x+yx+y-A-A1 1x+yx+y= =k(Ak(A2 2x x+A+A2 2y y)-A)-A1 1x x-A-A1 1y y=kA=kA2 2x x-A-A1 1x x=(kE=(kE2 2x x-E-E1 1x x) )C Cx x . .b.b.系数倍率法系数倍率法 1 2xyA 2kA 2A 1 A A导数光谱法：可以给出更多信息，提高导数光谱法：可以给出更多信息，提高分辨能力，能鉴别分子结构细微差别。分辨能力，能鉴别分子结构细微差别。特点：特点：p157 零阶零阶光谱光谱 A=ECl一阶导数光谱一阶导数光谱 dAd =dEd Cld2Ad2 =d2Ed

11、2 Cl二阶导数光谱二阶导数光谱 .导数光谱法定量分析示意图导数光谱法定量分析示意图200250300褶合光谱法定量分析功能褶合光谱法定量分析功能 ( (一一) )单组分定量分析单组分定量分析 ( (二二) )双组分定量分析双组分定量分析 ( (三三) )多组分定量分析多组分定量分析苯酚苯酚- -间苯二酚双组分体系的褶合光谱图间苯二酚双组分体系的褶合光谱图-1-1 苯酚苯酚(1)(1)，间苯二酚，间苯二酚(2)(2)，混合物，混合物(3)(3) 在苯酚的过零点在苯酚的过零点(271.90(271.90nm)nm)计算间苯二酚含量计算间苯二酚含量312312苯酚苯酚- -间苯二酚双组分体系的褶合

12、光谱图间苯二酚双组分体系的褶合光谱图-2-2 苯酚苯酚(1)(1)，间苯二酚，间苯二酚(2)(2)，混合物，混合物(3)(3) 在间苯二酚的过零点在间苯二酚的过零点(280.64(280.64nm)nm)计算苯酚含量计算苯酚含量 其它其它化学计量学化学计量学方法方法多元线性回归法（多元线性回归法（MLRMLR）KalmanKalman滤波法滤波法偏最小二乘法（偏最小二乘法（PLSPLS）主成分回归法（主成分回归法（PCRPCR） 紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 在药学各学科中的应用在药学各学科中的应用( (一一) )无机化学无机化学( (二二) )有机化学有机化学/ /药物化学药物

13、化学( (三三) )天然药物化学天然药物化学/ /生药学生药学( (四四) )药理学药理学/ /生化药学生化药学( (五五) )药剂学药剂学( (一一) )无机化学无机化学1 1、（混合）金属离子、（混合）金属离子 NaNa+ +/Mg/Mg2+2+、AgAg+ +/Cu/Cu2+2+、FeFe2+2+/ /FeFe3+3+、 CrCr3+3+/Cr/Cr6+6+、CaCa2+2+、HgHg2+2+ etc.etc.2 2、其它无机离子、其它无机离子 HClHCl/ /HAcHAc、KIOKIO3 3/I/I2 2、NONO2 2- - etc.etc.常用显色剂：常用显色剂：偶氮胂类、偶氮氯

14、膦类、卟啉类、偶氮胂类、偶氮氯膦类、卟啉类、铬天青铬天青S S、罗丹明、罗丹明B B、四苯基硼酸萘、四苯基硼酸萘胺、偶氮吡啶间苯二酚、四环素、胺、偶氮吡啶间苯二酚、四环素、苯甲酰茚满、氧氟沙星、苯甲酰茚满、氧氟沙星、8-8-羟基喹羟基喹啉、二甲酚橙等啉、二甲酚橙等图图 KMnOKMnO4 4试剂空白试剂空白(1)(1)与与NaNONaNO2 2作用作用(2)(2)的的VisVis光谱光谱525525nmnm( (二二) )有机化学有机化学/ /药物化学药物化学1 1、结构解析、结构解析2 2、中间体中间体/ /产物的纯度检查产物的纯度检查3 3、中间体中间体/ /产物的稳定性试验产物的稳定性试

15、验4 4、其它其它 反应是否发生及机理研究反应是否发生及机理研究 etc.etc.图图 偶氮染料偶氮染料Azo7Azo7在碱性在碱性DMFDMF溶溶液中光照前后的液中光照前后的UV/UV/VisVis光谱光谱图图 聚苯胺聚苯胺(PANI)(PANI)掺杂樟脑磺掺杂樟脑磺酸酸(CSA)(CSA)前后的前后的UV/UV/VisVis光谱光谱图图 卟啉化合物卟啉化合物TAPPTAPP与与cfDNAcfDNA作作用后的用后的VisVis光谱光谱( (SoretSoret带带) )图图 白蛋白与苯甲酸钠白蛋白与苯甲酸钠(0.0-(0.0-0.50mmol/L)0.50mmol/L)作用后的作用后的UVU

16、V光谱光谱( (三三) )天然药物化学天然药物化学/ /生药学生药学1 1、总生物碱、总黄酮、总皂苷、总生物碱、总黄酮、总皂苷 等的定量分析等的定量分析2 2、药材鉴别药材鉴别 紫外光谱紫外光谱/ /紫外谱线组法紫外谱线组法3 3、其它其它图图 枳芩合剂枳芩合剂(1)(1)、黄芩苷对照品、黄芩苷对照品(2)(2)和阴性和阴性对照液对照液(3)(3)的的UVUV光谱光谱278nm278nmA A242nm242nm图图 复方银黄口服液阳性复方银黄口服液阳性(a)(a)与与空白空白(b)(b)的的UVUV光谱光谱图图 马钱子粉中士的宁马钱子粉中士的宁(a)(a)与空与空白白(b)(b)的的UVUV

17、光谱光谱酸性染料比色法酸性染料比色法：在一定：在一定pHpH介质中，生物介质中，生物碱类碱类(B)(B)与氢离子与氢离子(H(H+ +) )成阳离子成阳离子(BH(BH+ +) )，一，一些酸性染料（如溴麝香草酚蓝、溴甲酚绿些酸性染料（如溴麝香草酚蓝、溴甲酚绿、溴酚蓝、甲基橙等）在此条件下可解离、溴酚蓝、甲基橙等）在此条件下可解离成阴离子成阴离子(In(In- -) )，与上述阳离子，与上述阳离子(BH(BH+ +) )定量定量地结合成有色的络合物地结合成有色的络合物(BH(BH+ +InIn- -) )，从而被，从而被某些有机溶剂定量地某些有机溶剂定量地提取提取，选择一定的波，选择一定的波长

18、测定吸收度值，即得生物碱含量。长测定吸收度值，即得生物碱含量。半夏、山药的乙醇提取液半夏、山药的乙醇提取液的的UVUV光谱图光谱图( (1.1.半夏半夏 2.2.水半夏水半夏 3.3.掌叶半夏掌叶半夏 4.4.天南星天南星 5.5.山药山药 6.6.腾冲山药腾冲山药 7.7.木薯根木薯根) )红曲的甲醇提取液红曲的甲醇提取液UV/UV/VisVis光谱图光谱图( (1.1.橙色红曲橙色红曲 2.2.变红变红红曲红曲 3.3.发白红曲发白红曲 4.4.巴克红曲巴克红曲 5.5.红色红曲红色红曲 6.6.紫红红曲紫红红曲 7.7.烟烟色红曲色红曲 8.8.土曲霉土曲霉) )紫外光谱法紫外光谱法怀牛

19、膝和红牛膝怀牛膝和红牛膝的的4 4溶剂浸液紫外溶剂浸液紫外谱线组图谱峰位谱线组图谱峰位值比较值比较紫花地榆和白花紫花地榆和白花地榆的地榆的4 4溶剂浸溶剂浸液紫外谱线组图液紫外谱线组图谱峰位值比较谱峰位值比较紫外谱线组法紫外谱线组法( (四四) )药理学药理学/ /生化药学生化药学1 1、酶活力（效价）测定、酶活力（效价）测定 木瓜蛋白酶、谷胱甘肽过氧化木瓜蛋白酶、谷胱甘肽过氧化 物酶、脂肪酶、碱性磷酸酶、物酶、脂肪酶、碱性磷酸酶、 对氧磷酶、酯酶对氧磷酶、酯酶 etc.etc.2 2、其它其它 DNADNA纯度检查、生物体液药物纯度检查、生物体液药物 含量含量 etc.etc.酶活力酶活力是

20、酶催化生化反应能力的表是酶催化生化反应能力的表征，一般以在规定条件下，每征，一般以在规定条件下，每mlml酶酶溶液，每分钟促进或抑制某生化反溶液，每分钟促进或抑制某生化反应达某程度应达某程度( (如如5050%) )时的酶量定义时的酶量定义为为1 1个酶活力单位。个酶活力单位。酶活力酶活力 = = K K A A其中，其中，K K为常数，为常数，A A为酶（或底物为酶（或底物、产物）作用前后的吸收度差值。、产物）作用前后的吸收度差值。图图 MMOMMO还原还原酶酶随随NADHNADH( (底物底物) )加入加入量增加量增加(14)(14)的的UV/UV/VisVis光谱变化光谱变化460460

21、nmnm图图 过氧化物酶氧化邻苯二胺过氧化物酶氧化邻苯二胺( (底物底物) )的的UV/UV/VisVis光谱变化光谱变化( (扫描间隔扫描间隔0.30.3min)min)220220nmnm422422nmnm图图 鱼精鱼精DNA(1)DNA(1)、苯酚、苯酚(2) (2) 、N-N-乙酰乙酰-L-L-色氨酰胺色氨酰胺(3)(3)、N-N-乙酰乙酰-L-L-酪氨酰胺酪氨酰胺(4)(4)、N-N-乙酰乙酰L-L-苯丙氨酸乙酯苯丙氨酸乙酯(5)(5)、内毒素、内毒素(6)(6)的的UVUV光谱光谱( (五五) )药剂学药剂学1 1、均匀度测定、均匀度测定2 2、溶出度测定溶出度测定3 3、制剂、

22、配伍稳定性制剂、配伍稳定性4 4、其它其它 体外吸附试验体外吸附试验 etc.etc.表表 头孢吡肟和甲硝唑混合液的头孢吡肟和甲硝唑混合液的含量、含量、pHpH值变化值变化(n=3,25(n=3,251)1)图图 头孢吡肟、甲硝唑的头孢吡肟、甲硝唑的UVUV光谱光谱双波长等吸双波长等吸收点法收点法系数倍率系数倍率法法头孢吡肟头孢吡肟甲硝唑甲硝唑/ /?紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 设计性实验设计性实验目的目的教员：提高学员学习兴趣，提升教学质量教员：提高学员学习兴趣，提升教学质量 发现适合发现适合“第二课堂第二课堂”的苗子的苗子 实验教学新模式的改革与探索实验教学新模式的改革与探

23、索学员：见识学员：见识“验证性验证性”实验以外的实验模式实验以外的实验模式 锻炼初步的科研思维锻炼初步的科研思维 锻炼综合能力与动手能力锻炼综合能力与动手能力内容内容利用已学习的紫外光谱定量分析方法利用已学习的紫外光谱定量分析方法（解线性方程组法、等吸收双波长消（解线性方程组法、等吸收双波长消去法、系数倍率法、导数光谱法、褶去法、系数倍率法、导数光谱法、褶合光谱法等），自行设计实验方案并合光谱法等），自行设计实验方案并分析下列双组分体系：分析下列双组分体系： 乙酰水杨酸乙酰水杨酸( (阿司匹林阿司匹林)+)+水杨酸水杨酸图图 水杨酸水杨酸(1)(1)、乙酰水杨酸、乙酰水杨酸(2)(2)和和乙酰

24、水杨酸乙酰水杨酸+ +水杨酸水杨酸( (3)3)的的UVUV光谱光谱A A220 250 300 nm220 250 300 nm1 13 32 2查阅文献或图书资料查阅文献或图书资料紫外光谱实验网络教学紫外光谱实验网络教学设计实验方案设计实验方案(多组多个多组多个)列出所需试剂等材料列出所需试剂等材料师生讨论确定实验方案师生讨论确定实验方案准备实验用试剂准备实验用试剂讨论并修正实验方案讨论并修正实验方案按最后方案开展实验按最后方案开展实验讨论讨论(预预)实验的问题原因及实验的问题原因及解决办法、各方案的优缺点解决办法、各方案的优缺点熟悉紫外光谱仪熟悉紫外光谱仪按实验方案开展预实验按实验方案开展预实验设计阶段设计阶段实验阶段实验阶段总结阶段总结阶段设计性实验汇报设计性实验汇报实施实施报名方式：自愿报名，择优遴选报名方式：自愿报名，择优遴选时时 间：遴选间：遴选( 2003.5.09 2003.5.09 ) 设计设计( 2003.5.26 2003.5.26 ) 实验实验( 2003.6.16 2003.6.16 ) 总结总结( 2003.6.24 2003.6.24 )联联 系系 人：人：70389-3(汪汪), -5(陆陆)Thanks