核酸化学 核苷酸代谢课件.ppt

1、王王 志志 宇宇广州中医药大学基础医学部广州中医药大学基础医学部广州中医药大学第二附属医院广州中医药大学第二附属医院广东省中医药科学院广东省中医药科学院 1868年年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取从脓细胞中提取“核素核素” 1944年年 Avery等人等人证实证实DNA是遗传物质是遗传物质 1953年年 Watson和和Crick发现发现DNA的双螺旋结构的双螺旋结构 1968年年 Nirenberg发现发现遗传密码遗传密码 1975年年 Temin和和Baltimore发发现现逆转录酶逆转录酶 1981年年 Gilbert和和Sanger建建立立DNA 测序方法测序方法

2、1985年年 Mullis发明发明PCR 技术技术 1990年年 美国启动美国启动人类基因组计划人类基因组计划(HGP) 1994年年 中国人类基因组计划启动中国人类基因组计划启动 2001年年 美、英等国美、英等国完成人类基因组计划基本框架完成人类基因组计划基本框架一、核酸的发现和研究工作进展一、核酸的发现和研究工作进展 二、核酸的分类及分布、功能二、核酸的分类及分布、功能(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸 90% 90%以上分布于细胞核，其余分布于以上分布于细胞核，其余分布于核外核

3、外如线粒体，叶绿体，质粒等。如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。分布于胞核、胞液。携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型体的基因型(genotype)。参与细胞内参与细胞内DNA遗传信息的表遗传信息的表达。某些病毒达。某些病毒RNA也可作为遗也可作为遗传信息的载体。传信息的载体。主要元素组成：主要元素组成： C、H、O、N、P(911%)与蛋白质比较，核酸与蛋白质比较，核酸一般不含一般不含S，而，而P的含量较的含量较为稳定，占为稳定，占9-11%。 二、基本构成单位：核苷酸二、基本构成单位：核苷酸(nucleotide)核苷酸由核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱戊糖、磷

4、酸和含氮碱三部分构成三部分构成( (一）戊糖一）戊糖pentose 脱氧核糖（脱氧核糖（DNADNA） deoxyribose 核糖（核糖（RNARNA） riboseOHHOHHHHCH2OHOHOHHOHOHHHCH2OHOH脱氧核糖核糖（二）碱基（二）碱基base 1)1)嘌呤嘌呤purine腺腺嘌呤（嘌呤（A） adenine鸟嘌呤（鸟嘌呤（G） guanine2)2)嘧啶嘧啶pyrimidine胞嘧啶胞嘧啶（C） cytosine胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T） thymine尿嘧啶（尿嘧啶（U） uracilNNHNNNH2NNHNNHNH2OAG腺嘌呤 鸟嘌呤NHNNH2ONHNHOON

5、HNHOOCH3CUT胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶嘌呤嘌呤(purine) NNNHN123456789NNNHNNH2腺嘌呤腺嘌呤(adenine, A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine, G)NNH132456嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C)NNHNH2O尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U)NHNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T)NHNHOOCH3NHNNH2CH3ONNNNHNHCH3NNHNNHONHNHORO5-甲基胞嘧啶 假尿嘧啶 N6-甲基腺嘌呤 次黄嘌呤l嘌呤碱和嘧嘌呤碱和嘧啶碱分子中啶碱分子中都含有共轭都含有共轭双键

6、体系，双键体系，在紫外区有在紫外区有吸收（吸收（260 260 nmnm左右）。左右）。l 糖与碱基之间的糖与碱基之间的C-NC-N键，称为键，称为C-NC-N糖苷键糖苷键。核糖核苷：核糖核苷：AR, GR, UR, CRAR, GR, UR, CR脱氧核苷：脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCRdAR, dGR, dTR, dCR核苷酸核苷酸(ribonucleotide)(ribonucleotide)的结构与命名的结构与命名核苷和磷酸以核苷和磷酸以磷酸酯键磷酸酯键连接连接OHHOHOHHHACH2OH2O3POHHOOHHHACH2OHOHHOHOHHACH2OHPO3H2H2O

7、3P5核苷酸 3核苷酸 2核苷酸RNA RNA DNADNA腺苷一磷酸腺苷一磷酸/ /腺苷酸（腺苷酸（AMPAMP） Adenosine Monophosphate Adenylic Acid脱氧腺苷酸（脱氧腺苷酸（dAMPdAMP）deoxy-鸟苷酸（鸟苷酸（GMPGMP） guanosine guanylic acid脱氧鸟苷酸（脱氧鸟苷酸（dGMPdGMP）deoxy-胞苷酸（胞苷酸（CMPCMP）cytidine cytidylic acid脱氧胞苷酸（脱氧胞苷酸（dCMPdCMP） deoxy-尿苷酸（尿苷酸（UMPUMP）uridine uridylic acid脱氧胸苷酸（脱氧胸

8、苷酸（dTMPdTMP）thymidylic acidATPATP的性质的性质 ATP ATP 分子的最显著特点是含有分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。两个高能磷酸键。ATPATP水解时水解时, , 可以释放出大量自由能。可以释放出大量自由能。 ATP ATP 是生物体内最重要的能量是生物体内最重要的能量转换中间体。转换中间体。ATP ATP 水解释放出水解释放出来的能量用于推动生物体内各来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。种需能的生化反应。 ATP ATP 也是一种很好的磷酰化剂。也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。

9、磷的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。化学反应的激活步骤。cAMPcAMP和和cGMPcGMP cAMP(3cAMP(3,5,5- -环化腺环化腺苷酸苷酸) )和和cGMP(3cGMP(3,5,5- -环化鸟苷酸环化鸟苷酸) )的主要的主要功能是作为细胞的功能是作为细胞的第二信使。第二信使。 cAMPcAMP和和cGMPcGMP的环状的环状磷酯键是一个高能磷酯键是一个高能键。在键。在pH7.4, cAMPpH7.4, cAMP和和cGMPcGMP的水解能约的水解能约为为43.9 K

10、J/mol43.9 KJ/mol，比，比ATPATP水解能高得多。水解能高得多。是核酸是核酸DNADNA、RNARNA的合成原料（的合成原料（ NTPNTP和和dNTP)dNTP)直接为生命活动提供能量直接为生命活动提供能量(NTP)(NTP)核苷酸衍生物是许多生物合成中的活化中间产物核苷酸衍生物是许多生物合成中的活化中间产物( (如如UDP-GAUDP-GA、PAPSPAPS、CDPCDP、胆碱）、胆碱）腺苷酸构成酶的辅助因子腺苷酸构成酶的辅助因子( (如如FMN FMN 、 FAD FAD 、NADHNADH）调节体内代谢调节调节体内代谢调节(cAMP cGMP )(cAMP cGMP )

11、核苷酸的功能核苷酸的功能一、一级结构（一、一级结构（primary structure）一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。1、核苷酸的连接方式：、核苷酸的连接方式： 3 , 5 磷酸二酯键磷酸二酯键2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链、核酸的基本结构形式：多核苷酸链n信息量：信息量：4nn末端：末端： 5 端、端、 3 端端n多核苷酸链的方向：多核苷酸链的方向： 5端端3端端(由左至右由左至右)3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写、表示方法：结构式、线条式、文字缩写

12、 碱基组成分析碱基组成分析Chargaff 规规则：则：A = T；G C 碱基的理化数据分析：碱基的理化数据分析：A-T、G-C以以氢键氢键配对较合理配对较合理 DNA纤维的纤维的X-线衍射图谱分析线衍射图谱分析 DNA双螺旋结构的研究背景双螺旋结构的研究背景 二、二、DNA的空间结构的空间结构（一）（一）DNA的二级结构（的二级结构（secondary structure）1、碱基组成规则、碱基组成规则(Chargaff规则规则)nA=T，G=C； A+G=T+C(嘌呤与嘧啶的总数相等嘌呤与嘧啶的总数相等)n有种属特异性有种属特异性n无组织、器官特异性无组织、器官特异性n不受年龄、营养、性

13、别及其他环境等影响不受年龄、营养、性别及其他环境等影响 DNADNA分子由两条分子由两条DNADNA单单链组成。链组成。 DNADNA的双螺旋结构是分的双螺旋结构是分子中两条子中两条DNADNA单链之间单链之间基团相互识别和作用基团相互识别和作用的结果。的结果。 双螺旋结构是双螺旋结构是DNADNA二级二级结构的最基本形式。结构的最基本形式。DNADNA双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点double helix modelDNADNA双螺旋结构的要点双螺旋结构的要点（1 1）DNADNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链( (简简称称DNADNA单链单链) )组成。两条

14、链沿着同一根轴平行盘组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为向相反，即其中一条链的方向为5 5 端端3 3 端，端，而另一条链的方向为而另一条链的方向为3 3 端端5 5 端。端。（2 2）嘌呤和嘧）嘌呤和嘧啶 碱 基 位 于啶 碱 基 位 于螺旋的内侧，螺旋的内侧，磷 酸 和 脱 氧磷 酸 和 脱 氧核 糖 基 位 于核 糖 基 位 于螺 旋 外 侧 。螺 旋 外 侧 。碱 基 环 平 面碱 基 环 平 面与 螺 旋 轴 垂与 螺 旋 轴 垂直 ， 糖 基 环直 ， 糖 基 环平 面 与 碱 基

15、平 面 与 碱 基环 平 面 成环 平 面 成9090角。角。（3 3）螺旋横截面的）螺旋横截面的直径约为直径约为2nm2nm，每，每条链相邻两个碱条链相邻两个碱基平面之间的距基平面之间的距离为离为0.34 nm0.34 nm，每，每1010个核苷酸形成个核苷酸形成一个螺旋，其螺一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转矩（即螺旋旋转一圈的高度）为一圈的高度）为3.4 nm3.4 nm。（4 4）维持两条）维持两条DNADNA链相链相互结合的力是链间碱基互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规合具有严格的配对规律律:A:A与与T T结合，结合，G G与与C C结结合，这

16、种配对关系，称合，这种配对关系，称为碱基互补。为碱基互补。A A和和T T之间之间形成两个氢键，形成两个氢键，G G与与C C之之间形成三个氢键。间形成三个氢键。 在在DNADNA分子中，嘌呤碱分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的基的总数与嘧啶碱基的总数相等。总数相等。（5 5）螺旋表面形成大）螺旋表面形成大沟沟(major groove)(major groove)及及小沟小沟(minor groove)(minor groove)，彼此相间排列。小沟彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是较浅；大沟较深，是蛋白质识别蛋白质识别DNADNA碱基碱基序列的基础。序列的基础。（6 6）氢键）氢键维持双

17、链维持双链横横向稳定性向稳定性，碱基堆积碱基堆积力力维持双链维持双链纵向稳定纵向稳定性性。（二）二级结构：（二）二级结构： 双螺旋结构模型双螺旋结构模型(double helix model)1、Watson-Crick双螺旋结构模型双螺旋结构模型(B-DNA) （1）反平行双链：脱氧核糖）反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧碱基对位于内侧 （2）碱基互补配对：）碱基互补配对：AT配对（两个氢键），配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴（3）右手双螺旋：螺距为）右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直径为，直

18、径为2.0 nm，10bp/圈圈（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别白质识别DNA碱基序列的基础碱基序列的基础 （5）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定3、其他螺旋形式、其他螺旋形式n Z-DNA（左手双螺旋）（左手双螺旋）n A-DNADNA双螺旋结构的多样性双螺旋结构的多样性A form:右手螺旋大沟变深小沟变浅11bp/ 螺旋螺距2.9nm直径2.6nmZ form:左手螺旋只有一条沟槽窄而深12bp/ 螺旋螺距4.5 nm直径1.8

19、 nmDNADNA双螺旋的稳定性双螺旋的稳定性 DNADNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。双螺旋结构在生理条件下很稳定。 维持这种稳定性的因素包括：两条维持这种稳定性的因素包括：两条DNADNA链之间形链之间形成的成的氢键，碱基堆积力氢键，碱基堆积力。 双螺旋结构双螺旋结构内部形成的疏水区内部形成的疏水区，消除了介质中，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；水分子对碱基之间氢键的影响； 介质中的介质中的阳离子阳离子（如（如NaNa+ +、K K+ +和和MgMg2+2+）中和了磷酸）中和了磷酸基团的负电荷，降低了基团的负电荷，降低了DNADNA链之间的排斥力等。链之间的排斥力等。 改变介质条

20、件和环境温度，将影响双螺旋的稳改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。定性。 天然存在的天然存在的DNA分子最显著的特分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在点是很长，分子质量很大，一般在1061010。l大肠杆菌染色体由大肠杆菌染色体由400万碱基对万碱基对(basepair，bp)组成的双螺旋组成的双螺旋DNA单单分子。其长度为分子。其长度为1.4106nm，相当于，相当于1.4mm，而直径为，而直径为20nm，相当原子，相当原子的大小。的大小。l黑腹果蝇最大染色体由黑腹果蝇最大染色体由6.2107bp组成，长组成，长2.1cml多瘤病毒的多瘤病毒的DNA由由5100bp组成组成

21、 ，长长1.7mm（二）（二）DNADNA的三级结构的三级结构双螺旋进一步扭曲双螺旋进一步扭曲, ,形成一种比双螺旋更高形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：线状层次的空间构象。包括：线状DNADNA形成的纽形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状结、超螺旋和多重螺旋、环状DNADNA形成的结、形成的结、超螺旋和连环等超螺旋和连环等大多数原核生物大多数原核生物 ：1 1）共价封闭的环状）共价封闭的环状双螺旋分子双螺旋分子2 2）超螺旋结构：双）超螺旋结构：双螺旋基础上的螺旋化螺旋基础上的螺旋化正超螺旋正超螺旋(positive (positive supercoil):supercoil):盘绕

22、方向盘绕方向与双螺旋方同相同与双螺旋方同相同负超螺旋负超螺旋(negative (negative supercoil):supercoil):盘绕方向盘绕方向与双螺旋方向相反与双螺旋方向相反 右手右手左手左手（三）（三）DNA在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装核小体核小体(nucleosome)： 由由DNA和组蛋白构成。和组蛋白构成。DNA：以负超螺旋缠：以负超螺旋缠绕在组蛋白上绕在组蛋白上组蛋白核心：组蛋白核心：H2B ,H2A ,H3 ,H4H2B ,H2A ,H3 ,H4H1H1组蛋白在核小体之间组蛋白在核小体之间DNA的存在形式DNA双螺旋片段双螺旋片段染色质纤染色质

23、纤维维伸展形染色质片段伸展形染色质片段密集形染色质片段密集形染色质片段整个染色整个染色体体串珠状核小体串珠状核小体（三）（三）DNA的功能的功能DNA的基本功能是以的基本功能是以基因基因的形式荷载遗的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。的信息基础。基因从结构上定义，基因从结构上定义，是指是指DNA分子中的分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。因的功能。 三、三、RNA的分子结构的分子结构RNARNA的结

24、构特点的结构特点 RNARNA是单链分子，因此在是单链分子，因此在RNARNA分子中，分子中，嘌呤的总嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数数不一定等于嘧啶的总数。 RNARNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为种结构称为“发夹型发夹型”结构结构。 在在RNARNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNADNA中严格。中严格。G G 除了可以和除了可以和C C 配对外，也可以配对外，也可以和和U U 配对配对。G-U G-U 配对形成的氢键较

25、弱。不同类配对形成的氢键较弱。不同类型的型的RNA, RNA, 其二级结构有明显的差异。其二级结构有明显的差异。 tRNAtRNA中除了常见的碱基外，还存在一些中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱稀有碱基基，这类碱基大部分位于突环部分，这类碱基大部分位于突环部分. .（一）信使（一）信使RNA的结构与功能的结构与功能* * 真核生物真核生物mRNA的的结构特点结构特点1. 大多数真核大多数真核mRNA的的5 末端均在转录后加上末端均在转录后加上一个一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C 2也也是甲基化，形成帽子结构：是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。2.

26、大多数真核大多数真核mRNA的的3 末端有一个多聚腺苷酸末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚结构，称为多聚A尾。尾。帽子结构和多聚帽子结构和多聚A尾的功能尾的功能5-cap的功能 (1) 防止mRNA被核酸酶降解。(2) 为mRNA翻译活性所必需。(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。3-polyA : polyA的残基数20200个，或更多。polyA的功能 (2) 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。(1) 保护mRNA，免受核酸外切酶的作用。hnRNA 内含子内含子( (intron) )mRNA 外显外显子子( (exon) )

27、* 真核生物真核生物mRNA成熟过程成熟过程* mRNA的功能的功能 把把DNA所携带的遗传信息，按碱基互所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。DNAmRNA蛋白蛋白转录转录翻译翻译原核细胞原核细胞 细胞质细胞质细胞核细胞核DNA内含子内含子外显子外显子转录转录转录后剪接转录后剪接转运转运mRNAhnRNA翻译翻译蛋白蛋白真核细胞真核细胞 （二）（二）tRNA的结构与功能的结构与功能* tRNA的一级结构特点的一级结构特点 含含 1020% 稀有碱基，稀有碱基，如如

28、DHU 3 末端为末端为 - CCA-OH 5 末端大多数为末端大多数为G 具有具有 T C NHNHOOHHHH双氢尿嘧啶双氢尿嘧啶(DHU)假尿嘧啶假尿嘧啶( )次黄嘌呤次黄嘌呤(I)* tRNA的二级结构的二级结构三叶草形三叶草形 氨基酸臂氨基酸臂 DHU环环 反密码环反密码环 额外环额外环 TC环环氨基酸氨基酸臂臂额外环额外环* tRNA的功能：的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。参与蛋白质的翻译。1、分子较小，含较多的稀有碱基和非标准碱基配对、分子较小，含较多的稀有碱基和非标准碱基配对2、5端一般为鸟嘌呤核苷酸，端一般为鸟嘌呤核苷酸，3端为端

29、为CCA-OH3。3、二级结构为、二级结构为“三叶草三叶草”型（型（cloverleaf pattern）小结小结n反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与mRNA的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗传密码，称为反密码子（传密码，称为反密码子（anticodon）。）。I常出现常出现于反密码子中于反密码子中ACCDHU环环T 环环反密码环反密码环5额外环额外环n氨基酸臂：氨基酸臂：3末端的末端的CCA-OH3单链单链用于连接该用于连接该tRNA转运的氨基酸。转运的氨基酸。 n二氢尿嘧啶环（二氢尿嘧啶环（DHU）：识别）：识

30、别氨酰氨酰-tRNA合成酶合成酶nTC环：识别核蛋白体（核环：识别核蛋白体（核糖体）糖体）4、“倒倒L”型三级结构型三级结构（三）（三）rRNA的结构与功能的结构与功能原核生物（以大肠杆菌为例）原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸个核苷酸18S1874个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质21种种占总重量的占总重量的40%33种种占总重量的占总重量的50%大亚基大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸个核苷酸160个核苷酸个核苷酸120

31、个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质31种种占总重量的占总重量的30%49种种占总重量的占总重量的35%核蛋白体的组成核蛋白体的组成* rRNArRNA的功能的功能: :组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。（四）其他小分子（四）其他小分子RNA及及RNA组学组学除了上述三种除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子的许多其他种类的小分子RNA，统称为，统称为非非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或或非编码蛋白质的非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA, nc

32、RNA) 。 种类：种类：核内小核内小RNARNA；核仁小；核仁小RNARNA；胞质小；胞质小RNARNA；催化性小催化性小RNARNA；小片段干涉；小片段干涉 RNARNA功能：功能：参与参与hnRNA和和rRNA的加工和转运。的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。）。 小片段干扰小片段干扰RNA RNA （siRNAsiRNA；又称；又称“引导引导RNAsRNAs”，guide RNAsguide RNAs）：

33、一些小的双链）：一些小的双链RNARNA可以高效、特异可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使的阻断体内特定基因表达，促使mRNAmRNA降解，诱使细降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNARNA干扰（干扰（RNA RNA interferenceinterference，RNAiRNAi，也译作，也译作RNARNA干预或干涉）。干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。RNAiRNAi的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。（1 1）在起始步骤，生物宿主将外源基因表

34、达的）在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链双链RNARNA进行切割，产生具有特定长度（进行切割，产生具有特定长度（19-19-21nt21nt）和序列的小片段）和序列的小片段RNARNA；（2 2）在）在RNAiRNAi效应阶段，效应阶段，siRNAsiRNA双链结合一个核双链结合一个核酶复合物从而形成所谓酶复合物从而形成所谓RNARNA诱导沉默复合物诱导沉默复合物（RISCRISC）。激活）。激活RISCRISC需要一个需要一个ATPATP依赖的将依赖的将siRNAsiRNA解双链的过程。激活的解双链的过程。激活的RISCRISC通过碱基配对通过碱基配对定位到同源定位到同源mRNAmRN

35、A转录本上，并在距离转录本上，并在距离siRNA3siRNA3端端1212个碱基的位置切割个碱基的位置切割mRNAmRNA。RNARNA组学研究细胞中组学研究细胞中snmRNAs的种类、的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。的表达具有时间和空间特异性。 RNARNA组学组学: : 一、酸性化合物一、酸性化合物n 两性解离，但酸性强两性解离，但酸性强n 电泳行为电泳行为泳向正极（泳向正极（pH7-8） 二、高分子性质二、高分子性质n 粘度粘度 D

36、NARNAn 超离心沉降超离心沉降n 凝胶过滤凝胶过滤n 分子大小单位：分子量（道尔顿，分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、）、碱基对数目（碱基对数目（bp）、离心沉降常数（）、离心沉降常数（S） n 沉淀行为沉淀行为加盐（中和电荷）；乙醇加盐（中和电荷）；乙醇DNA和RNA中的糖苷键与磷酸酯键都能用化学法和酶法水解。并且碱基和核糖之间的糖苷键更易被水解，其中嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定。在很低pH条件下DNA和RNA都会发生磷酸二酯键水解。在高pH时，RNA的磷酸酯键易被水解，而DNA的磷酸酯键不易被水解。一、核酸的水解一、核酸的水解酸碱水解酸碱水解OHRNA-水解OHOH2C

37、HHHbaseHOOPOHO二、紫外吸收二、紫外吸收1. DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50 g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0OD260的应用的应用紫外吸收紫外吸收n 最大吸收波长：最大吸收波长：260nmn 核酸定量分析核酸定量分析n 核酸定性分析核酸定性分析 三、变性、复性、分子杂交三、变性、复性、分子杂交1、DNA变性（变性（DNA denaturation）

38、：）：DNA变性变性是指在理化因素作用下，是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。形成单链的过程。 DNA的变性的变性(denaturation)方法：方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：ODOD260260增高；粘度下增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线

39、改变；生物活性改变线改变；生物活性改变DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂DNADNA变性变性增色效应：增色效应：DNADNA变性时其溶液变性时其溶液ODOD260260增高的现象。增高的现象。 当当DNADNA的稀盐溶液加热到的稀盐溶液加热到80-10080-100时，双螺旋结构时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 80 90 100 100%50%OD260（254） Tm 变性温度范围变性温度范围融解温度（融解温度（melting temperature,Tmmelting temperatur

40、e,Tm）：）：DNADNA热变性热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（称为融解温度（TmTm）或解链温度、变性温度。）或解链温度、变性温度。 实验室常用的方法实验室常用的方法热变性热变性影响影响TmTm值的因素值的因素(1)(1)溶液的性质溶液的性质(2)DNA(2)DNA的性质和组成的性质和组成大肠杆菌大肠杆菌DNADNA在不同浓度在不同浓度KClKCl溶液下的溶液下的熔融温度曲线熔融温度曲线nGC含量越高，含量越高，Tm越大越大 （1）变性后理化性质改变）变性后理化性质改变nDNA溶液的粘度降低溶液的粘度降低n浮力密度

41、增加浮力密度增加n旋光偏振光改变旋光偏振光改变n紫外吸收增加（高色效应）紫外吸收增加（高色效应）高色效应（高色效应（hyperochromic effect）：）：DNA变变性后，在性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。应或增色效应。 （2）变性后的）变性后的DNA一级结构没有改变。一级结构没有改变。（3）融解温度（）融解温度（melting temperature,Tm）：）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（时溶液的温度称为融解温度（Tm）GC含量越高，含量越高，Tm

42、越大越大DNA越长，越长，Tm越大越大溶液离子强度增高，溶液离子强度增高，Tm值增加值增加DNA越纯，相变范围越小越纯，相变范围越小 2、DNA复性复性DNA复性复性(renaturation)的定义的定义:在适当条件下，在适当条件下，变性变性DNADNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为这一现象称为复性复性。热变性的热变性的DNADNA经缓慢冷却后即可复性，这一过经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为程称为退火退火(annealing)(annealing) 。减色效应减色效应（hypochromic effect ）:DNA复性时，复性时，其溶

43、液其溶液OD260降低。降低。DNADNA复性复性在在DNA变性后的复性过程中，如果将不变性后的复性过程中，如果将不同种类的同种类的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可以在不同的DNA与与DNA之间形成，也可以在之间形成，也可以在DNA和和RNA分子间或者分子间或

44、者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为分子间形成。这种现象称为核酸核酸分子杂交分子杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization) 核核酸酸的的杂杂交交DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用: :研究基因的位置研究基因的位置确定两种核酸序列的相似性确定两种核酸序列的相似性检测样品中的特异序列检测样品中的特异序列基因芯片技术的基础基因芯片技术的基础 核酸探针（核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一能特异性的探测带某一特定序列的特定序列的DNA或或RNA分子的标

45、记核酸分子。分子的标记核酸分子。3、核酸分子杂交、核酸分子杂交(hybridization) n由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程n分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等析、疾病诊断等核酸的构象和分离 ：超螺旋DNA环状DNA线状DNA蛋白质 DNA 沉降沉降四、沉降特性 超螺旋DNA五、凝胶电泳 核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。 通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定

46、分子大小。 （3）估计核酸的构象。 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis） 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis） 用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段 适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。 DNA marker(DL-15000) ：15000，10000，7500，5000，2500，1000，250DNA marker(DL-2000) ： 2000 ，1000，750，500，2

47、50，100核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶是指所有可以水解核酸的酶 一、种类一、种类1、根据底物分类、根据底物分类nDNase、RNase；n单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶2、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶外切酶：外切酶：5 端端3 端或端或3 端端5 端核酸外切酶。端核酸外切酶。内切酶：内切酶：限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonucleases)：能：能够识别够识别DNA分子的特定

48、核苷酸序列，并在识别位点或其分子的特定核苷酸序列，并在识别位点或其周围断开周围断开DNA双链的一类核酸酶双链的一类核酸酶 限制性内切酶举例限制性内切酶举例 v参与参与DNA的合成与修复及的合成与修复及RNA合成后的剪合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程接等重要基因复制和基因表达过程 v负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 v在消化液中降解食物中的核酸以利吸收在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 v体外重组体外重组DNA技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶负责细胞内外催

49、化核酸的降解生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解 二、核酸酶的功能二、核酸酶的功能 三、核三、核 酶酶u 催化性催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。 u 催化性催化性RNA (ribozyme) 作为序列特异性的核作为序列特异性的核酸内切酶降解酸内切酶降解mRNA。 19941994：3 3亿美元测定一个人类基因组亿美元测定一个人类基因组(1:10)(1:10)19841984：3030亿美元测定一个人类基因组亿美元测定一个人类基因组未来目标：未来目标：1000/100 1000/100

50、 美元测定一个人类基因组美元测定一个人类基因组! !20042004：3 3千万美元测定一个人类基因组千万美元测定一个人类基因组(1:100)(1:100)20062006：1 1百百5050万美元测定一个人类基因组万美元测定一个人类基因组(1:2000)(1:2000)20082008：5050万美元测定一个人类基因组万美元测定一个人类基因组(1:6000)(1:6000)DNA测序技术的发展测序技术的发展测序技术的发展测序技术的发展 双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法测序法) 1970s 同位素标记，手工同位素标记，手工 1980s 荧光标记，自动荧光标记，自动 19