分子生物学课件-绪论+第一章.ppt

1、生命科学学院生命科学学院2010.82010.8Introduction是在分子水平上研究生命本质的一门新兴的是在分子水平上研究生命本质的一门新兴的边缘学科，是生物学研究从宏观发展到微边缘学科，是生物学研究从宏观发展到微观而形成的。终极目标是要了解所有生物观而形成的。终极目标是要了解所有生物学现象的分子本质。学现象的分子本质。是当前生命科学中是当前生命科学中发展最快并正在与发展最快并正在与其它学科广泛交叉其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿与渗透的重要前沿领域。领域。生物大分子生物大分子核酸核酸蛋白质蛋白质多糖多糖脂类脂类 它以核酸和蛋白质等生物它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息大分

2、子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研和细胞信息传递中的作用为研究对象。究对象。分子生物学分子生物学生物化学生物化学研究方向研究方向主要研究核酸、蛋白质和其它大主要研究核酸、蛋白质和其它大分子的结构和功能，及它们之间分子的结构和功能，及它们之间的相互作用。着重解决细胞中信的相互作用。着重解决细胞中信息传递的问题。息传递的问题。主要研究大、小分子在主要研究大、小分子在生命活动中的代谢转化生命活动中的代谢转化过程，如糖酵解、脂肪过程，如糖酵解、脂肪氧化、三羧酸循环等。氧化、三羧酸循环等。研究方法研究方法以以X-射线等物理学方法研究大分射线等物理学方法研究大分子结构，以生化与遗传相结合的子

3、结构，以生化与遗传相结合的方法探索其功能。方法探索其功能。采用生化和化学方法。采用生化和化学方法。重点是大分重点是大分子的结构与子的结构与功能功能重点是分重点是分子的代谢子的代谢转化转化DNADNA一级结构一级结构DNADNA二级结构二级结构DNADNA三级结构三级结构DNADNA的一级结构实际上的一级结构实际上就是就是DNADNA分子内碱基的分子内碱基的排列顺序。排列顺序。DNA的戊糖的戊糖2上没有自由羟基，很稳定，在上没有自由羟基，很稳定，在pH11.5时时DNA的一级结构几乎无变化；而的一级结构几乎无变化；而RNA的戊糖有的戊糖有2上的自由羟基，遇碱水解生上的自由羟基，遇碱水解生成成2,

4、3环式单核苷酸，极不稳定，很快转变成环式单核苷酸，极不稳定，很快转变成2单核苷酸和单核苷酸和3单核苷酸。单核苷酸。总结一下总结一下DNA和和RNA的异同点吧！的异同点吧！核酸实验核酸实验高度重复序列高度重复序列中度重复序列中度重复序列低度重复序列低度重复序列 重复频率高，几十万到几百万次；重复频率高，几十万到几百万次； 重复序列较短，重复序列较短，5300bp，多数为，多数为515bp； 有些是反向重复序列。有些是反向重复序列。 卫星卫星DNA回文结构回文结构 palindrome在高度重复序列中，有一种由富含AT的210bp成串排列组成的简单重复序列，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开

5、，因此把它叫做卫星DNA。分类分类微卫星微卫星DNA（microsatelletite DNA）小卫星小卫星DNA（minisatelletite DNA）重复频率重复频率重复序列长度重复序列长度具有种属特异性，具有种属特异性，常作为一种分子遗常作为一种分子遗传标记。传标记。 重复频率和重复序列长度重复频率和重复序列长度差异大；差异大； 有些成串集中排列，有些有些成串集中排列，有些与单拷贝序列间隔排列；与单拷贝序列间隔排列； 有些是编码蛋白质的结构有些是编码蛋白质的结构基因；基因； 一般有种的特异性，可作一般有种的特异性，可作为探针，区分不同种间细为探针，区分不同种间细胞胞DNA。 序列不重复

6、或只重复几次、十几次；序列不重复或只重复几次、十几次； 重复序列长度重复序列长度1000bp； 携带大量能编码功能蛋白质的遗传信息。携带大量能编码功能蛋白质的遗传信息。又称单又称单序序列列The Double Helix (1953) The foundation of molecular biology Francis H. Crick James D. Watson （1）反向平行，右手双螺旋；）反向平行，右手双螺旋；（2）糖与磷酸通过）糖与磷酸通过3,5- 磷酸二磷酸二酯键在外侧形成骨架；酯键在外侧形成骨架；（3）碱基在内部，平面与螺旋）碱基在内部，平面与螺旋轴垂直；轴垂直；（4）A=T

7、，G C；（5）直径为）直径为2nm，螺距为，螺距为3.4 nm，10bp/helix；（6）大沟（）大沟（major groove）和小）和小沟（沟（minor groove）氢键碱基堆积力静电斥力疏水力有利于维持双螺旋结构有利于维持双螺旋结构不利于维持双螺旋结构不利于维持双螺旋结构除除B-DNA外，人们还发现到了其它的结构参数有一定差外，人们还发现到了其它的结构参数有一定差异的异的DNA，如，如A-DNA, Z-DNA，三链和四链，三链和四链DNA等，这等，这一现象称为一现象称为。分子间的三螺旋分子间的三螺旋DNADNA分子内的三螺旋分子内的三螺旋DNADNA平行的三螺旋结构平行的三螺旋结

8、构 R-DNAR-DNAA-DNAA-DNA：周碱基数可变：周碱基数可变DNADNAZ-DNAZ-DNA：左旋：左旋DNADNADNA三螺旋结构中的第三条链三螺旋结构中的第三条链与第一条链的序列和方向均相与第一条链的序列和方向均相同，这种的同，这种的DNA叫叫G四联体螺旋：含有端粒重复序列的单链寡四联体螺旋：含有端粒重复序列的单链寡核苷酸可以形成四联体螺旋结构。核苷酸可以形成四联体螺旋结构。不同不同DNA结构形式相互转变的现象，称为结构形式相互转变的现象，称为。DNA基本结构：基本结构：B型型天然天然DNADNA分子中，分子中，以以B B型结构为主型结构为主在这个分子的某些区段在这个分子的某些

9、区段会出现会出现A、Z型，甚至三型，甚至三链、四链。链、四链。这些不同的结构处于动态变化中这些不同的结构处于动态变化中双链双链DNADNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态之中，特别是稳定性较低的富含状态之中，特别是稳定性较低的富含A-TA-T的区段，的区段，氢键的断裂和再生更为明显。在微观上，它们氢键的断裂和再生更为明显。在微观上，它们常常发生瞬间的单链泡状结构，这种现象称为常常发生瞬间的单链泡状结构，这种现象称为双螺旋的呼吸作用。双螺旋的呼吸作用。对于一些识别双链对于一些识别双链DNADNA开链成单链的蛋白质结合开链成单链的蛋白质结合到到DNADNA上

10、具有重要作用。这些蛋白质需要处于呼上具有重要作用。这些蛋白质需要处于呼吸状态的双链吸状态的双链DNADNA来阅读和识别来阅读和识别DNADNA内部所含信内部所含信息（如碱基序列、碱基上可以作用的氢供体、氢息（如碱基序列、碱基上可以作用的氢供体、氢受体的数目和方位等）。受体的数目和方位等）。是指是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的构象，包括线形双链中的纽结、超螺旋、多重形成的构象，包括线形双链中的纽结、超螺旋、多重螺旋、分子内局部单链环和环状螺旋、分子内局部单链环和环状DNA中的超螺旋及连中的超螺旋及连环等拓扑学性质。环等拓扑学性质。1、超螺旋、超螺旋DNA形状更紧密，在

11、形状更紧密，在DNA 组装中有重要作用；组装中有重要作用；2、超螺旋程度的改变介导了、超螺旋程度的改变介导了DNA结构的变化，有利于功能结构的变化，有利于功能的发挥；的发挥；3、超螺旋、超螺旋DNA能实现松弛态能实现松弛态DNA所不能实现的结构转化。所不能实现的结构转化。在物理和化学因素的影响下，维系核酸二级在物理和化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双链解旋成单链，这一过程称为双链解旋成单链，这一过程称为DNA的变的变性。性。1、核酸的变性可发生在整个、核酸的变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局分子中，也可发生在局部的双螺

12、旋节段上（局部变性）。部的双螺旋节段上（局部变性）。2、DNA变性不涉及核苷酸中二酯键的断裂。变性不涉及核苷酸中二酯键的断裂。3、引起变性的因素有酸、碱、尿素、胍等变性剂和乙醇、引起变性的因素有酸、碱、尿素、胍等变性剂和乙醇、丙酮等化学因素以及热、紫外线等物理因素。丙酮等化学因素以及热、紫外线等物理因素。4、变性后的、变性后的DNA其一系列的物理、化学性质都发生变化，其一系列的物理、化学性质都发生变化，如如260nm处紫外吸收值降低，粘度下降，沉降速度增加，处紫外吸收值降低，粘度下降，沉降速度增加，浮力密度上升等。浮力密度上升等。5、熔解曲线的中点，即一半的、熔解曲线的中点，即一半的DNA双螺

13、旋解为单链所对双螺旋解为单链所对应的温度称为熔解温度或解链温度。应的温度称为熔解温度或解链温度。6、每一种、每一种DNA都有一个解链温度，都有一个解链温度，Tm值是一个固定常数。值是一个固定常数。变性的变性的DNADNA重新恢复为双螺旋的过程，叫做重新恢复为双螺旋的过程，叫做复性或退火。复性或退火。分子碰撞分子碰撞时间长时间长核心作用核心作用时间短时间短拉拉链作用拉拉链作用限制因素限制因素 不完全变性不完全变性DNA容易迅速复性；容易迅速复性；复性复性DNA分子不一定是原有互补链，大分子不一定是原有互补链，大部分不是原配，而是形成杂交分子；部分不是原配，而是形成杂交分子；复性复性DNA分子的结

14、构和理化性质等均得分子的结构和理化性质等均得到恢复。到恢复。、DNA片段小的比大的容易复性。片段小的比大的容易复性。、盐可以减少两条互补链负电荷的排斥作用，通常增、盐可以减少两条互补链负电荷的排斥作用，通常增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。、DNA浓度越大，两条互补链彼此相遇的可能性越浓度越大，两条互补链彼此相遇的可能性越大，复性速度也越快。大，复性速度也越快。 一定的盐浓度一定的盐浓度 适宜的温度适宜的温度复性是分子杂交的理论基础复性是分子杂交的理论基础 亲缘关系很近的不同来亲缘关系很近的不同来源的源的DNADNA单链或单链或RNARNA单

15、链单链与与DNADNA单链之间通过碱单链之间通过碱基互补形成杂交分子的基互补形成杂交分子的过程过程, ,叫做核酸分子杂叫做核酸分子杂交。交。DNA/DNADNA/RNA根据核酸分子杂交的原理，有目的地人工制备或从基因根据核酸分子杂交的原理，有目的地人工制备或从基因组中分离一段已知序列的组中分离一段已知序列的DNA，使其带上标记，经变性，使其带上标记，经变性后成为单链，在一定条件下与待测后成为单链，在一定条件下与待测DNA单链杂交，如两单链杂交，如两者序列有同源性，就形成带有标记的双链者序列有同源性，就形成带有标记的双链DNA分子，即分子，即检测到了待测的检测到了待测的DNA。这段带有标记的核苷

16、酸序列称为。这段带有标记的核苷酸序列称为核酸探针或基因探针（核酸探针或基因探针（Gene probe）。）。DNADNA序列分析技术是揭开生命奥秘的一把金钥匙序列分析技术是揭开生命奥秘的一把金钥匙吴瑞士吴瑞士 引物引物- -延伸测序策略延伸测序策略19711971年首次成功地测定了年首次成功地测定了噬菌体两个粘性末端噬菌体两个粘性末端的完整序列。的完整序列。F.SangerF.Sanger末端终止法末端终止法K.MullisK.MullisPCRPCRM.SmithM.Smith碱基定点突变技术碱基定点突变技术利用脱氧核苷三磷酸（利用脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）的类似物双脱氧核）的类似物

17、双脱氧核苷三磷酸（苷三磷酸（ddNTPddNTP）取代正常的底物。）取代正常的底物。 在在DNA合成反应中除了加入合成反应中除了加入4种正常种正常dNTP外，再加外，再加入入1种少量的种少量的ddNTP，反应产物是一系列长短不一的核，反应产物是一系列长短不一的核苷酸链。在苷酸链。在4组独立的核苷酸反应中，分别加入组独立的核苷酸反应中，分别加入4种不同种不同的的ddNTP，结果生成，结果生成4组核苷酸链，它们分别终止于每组核苷酸链，它们分别终止于每一个一个A、T、C、G的位置上。对这的位置上。对这4组核苷酸进行聚丙组核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链烯酰胺凝胶电泳区分长度差一

18、个核苷酸的单链DNA ，可读出序列。可读出序列。 ddNTP可以在可以在DNA聚合酶作用下和多核苷酸聚合酶作用下和多核苷酸链的链的3羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。ddNTP的作的作用用方法过程方法过程聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNADNA聚合酶聚合酶 单链单链DNADNA模板模板 单链寡核苷酸引物单链寡核苷酸引物 MgMg2+2+ 4 4种种dNTP (dATP,dGTP,dCTPdNTP (dATP,dGTP,dCTP和和dTTPdTTP) ) 4 4种种ddNTP (ddATP,ddGTP,ddCTPddNTP (ddATP,ddGTP,ddCTP和和ddTTPddTTP) )实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。DNADNA自动测序仪自动测序仪