血红蛋白的提取和分离(上课用)介绍[课件参考].ppt

1、1精选课件 简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。本原理。凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳电泳法分离样品的原理法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 样品的预处理样品的预处理 色谱柱填料的处理色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。和色谱柱的装填。2精选

2、课件选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白质。的蛋白质。3精选课件 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或琼葡聚糖或琼脂糖脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。 根

3、据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，利用的大小，利用具有具有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用，来进行分离。作用，来进行分离。4精选课件分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于凝胶颗粒空大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于凝胶颗粒空小于凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从凝胶柱洗脱先从凝胶柱洗脱出来出来

4、后从凝胶柱洗脱后从凝胶柱洗脱出来出来一、基础知识一、基础知识-5精选课件6精选课件7精选课件 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质大的蛋白质 A A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快 C C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快D8精选课件 在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸外加少量强酸或强碱或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。 能够抵制外界的

5、酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变基本不变。9精选课件 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。, ,磷酸缓冲液磷酸缓冲液 利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的血红蛋白的正常结构和功能正常结构和功能，便于观察，便于观察( () )和科和科 学研究学研究( () )思考：说出人体血液中缓冲液思考：说出人体血液中缓冲液 NaH2PO4

6、/ Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO310精选课件带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子带电性带电性质质的差异以及的差异以及分子本身的大小，形状分子本身的大小，形状的不同，的不同，使带电分子产生不同的使带电分子产生不同的迁移速度迁移速度，从而实现样，从而实现样品中各种分子的分离品中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳凝胶电泳11精选课件蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀

7、：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离）粗分离：透析除去分子较小的杂质。：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。质蛋白质除去。（4）纯度鉴定）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。12精选课件样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定 血液组成血液组成成分成分 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 4.透析透析血红蛋白血红蛋白13精选课件14

8、精选课件每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。15精选课件阅读思考：洗涤的目的是什么？（阅读思考：洗涤的目的是什么？（P69：操作提示：操作提示）洗涤过程：洗涤过程：血液血液100mL100mL低速离心低速离心2 min2 min红细胞红细胞血血 浆浆红细胞红细胞搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠吸出血浆吸出血浆5倍体积生理盐水倍体积生理盐水16精选课件初次离心

9、后的结果17精选课件3次洗涤后的结果18精选课件阅读思考：阅读思考：1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂19精选课件磁力搅拌器返回返回20精选课件将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r

10、/min2000r/min的的速度离心速度离心10 min10 min。第第1 1层（最上层）：层（最上层）：甲苯层（甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（层（白色薄层固体白色薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红蛋白的水溶层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色暗红色）。）。用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体。

11、红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 滤纸滤纸过过滤滤烧杯烧杯离心离心管管分离过程分离过程21精选课件返回返回v 记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：层顺序自上而下是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀22精选课件 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），

12、透析1212小时。小时。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL1mL23精选课件24精选课件利用透析袋透析25精选课件纯化凝胶色谱操作纯化凝胶色谱操作1.1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填教材图教材图5193.3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱26精选课件 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆覆盖尼龙网，再用盖尼龙网，再用100100目尼龙纱

13、包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：。组装：将上将上述三者按相应位置组装成一个整体述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。27精选课件A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-G-7575）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G G”表示凝胶的交联程度，膨表示凝

14、胶的交联程度，膨胀程度及分离范围胀程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水胶膨胀时吸水7.57.5克。克。配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。配成凝胶悬浮液。A A、固定：、固定：将色谱柱将色谱柱装置固定在支架上。装置固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装

15、填时尽量紧密，以降低、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。凝胶颗粒之间的空隙。 2 2、装填凝胶柱时不得有气泡、装填凝胶柱时不得有气泡存在：存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果降低分离效果。28精选课件装配好的凝胶柱29精选课件装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时小时。1 1、液面不要低液面不要低于凝胶

16、表面，否则可能有气于凝胶表面，否则可能有气泡混入泡混入，影响液体在柱内的，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质流动与最终生物大分子物质的分离效果。的分离效果。2 2、不能发生洗不能发生洗脱液流干，脱液流干，露出凝胶颗粒的露出凝胶颗粒的现象现象。30精选课件打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。凝胶面。 加样后打开下端出

17、口，使样品渗入凝加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）果红色区

18、带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。31精选课件3.3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱32精选课件正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。33精选课件收集得到的纯化后的蛋白34精选课件注意事项注意事项1. 1. 红细胞的洗涤：红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗

19、涤次数不能过少；低速、短时离心。2. 2. 凝胶的预处理：凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3. 3. 色谱柱的装填：色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。液不能断流。4. 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。35精选课件让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜

20、色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：。首先通过洗涤红细胞、血红蛋。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，即，即: :样品的处理；样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后将相对分子质量较大的将相对分子质量较大的杂质蛋白除去杂质蛋白除去，

21、即，即: :样品样品的纯化；最后经的纯化；最后经进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。36精选课件观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成

22、了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况

23、。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 37精选课件 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效

24、果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。1.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? ?2.2.什么是缓冲溶液什么是缓冲溶液? ?它的作用是什么它的作用是什么? ?3.3.电泳的作用及其原理是什么电泳的作用及其原理是什么? ?4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? ?5.5.与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比, ,红细胞有什么特点红细胞有什么特点? ?这一特点对你进行这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义蛋白质的分离有什么意义? ?38精选课件血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定39精选课件