基因工程-第三章-基因工程的载体-PPT课件.ppt
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- 基因工程 第三 载体 PPT 课件
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1、2022-5-18第三章 基因工程的载体n载体:携带外源基因进入受体细胞的工具n用于基因工程的载体用于基因工程的载体细菌质粒载体噬菌体衍生载体Cosmid载体Phagemid载体酵母质粒载体真核病毒载体Bacmid载体YAC载体2022-5-18发展概况发展概况 1. 1. 第一阶段(第一阶段(19771977年前):年前):天然质粒和重组质粒的利用,天然质粒和重组质粒的利用,如如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar pBR322 (1977, Bolivar et alet al
2、) ) 2. 2. 第二阶段:第二阶段:增大载体容量(降低载体长度),建立多克增大载体容量(降低载体长度),建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如隆位点区和新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 3.3.第三阶段:第三阶段:进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求,如同要求,如M13mpM13mp系列载体,含系列载体,含T3T3,T7T7,sp6sp6启动子载体,表启动子载体,表达型载体及各种探针型载体。达型载体及各种探针型载体。 2022-5-18第三章 基因工程的载体n作为基因工程载体的基本功能基本功能1. 运送外源基因高效转
3、入受体细胞2. 为外源基因提供复制能力或整合能力3. 为外源基因的扩增或表达提供条件2022-5-18第三章 基因工程的载体n作为基因工程载体必须具备的基本条件基本条件1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3. 长度尽可能小,以提高其载装能力4. 具有多种单一的酶切位点5. 具有合适的选择性标记2022-5-18遗传标记基因遗传标记基因 1. 1. 标记基因的作用标记基因的作用 1 1)指示外源)指示外源DNADNA分子(载体或重组分子)分子(载体或重组分子)是否进入宿主是否进入宿主细胞细胞 这种指示可以是选择性的(这种指示可以是选择
4、性的(ApApr r ,TcTcr r ,KanKanr r),也可以),也可以是非选择性的(如是非选择性的(如lacZlacZ) 2 2)指示外源指示外源DNADNA分子分子是否插入载体分子是否插入载体分子形成了重组子。形成了重组子。 * * 这种指示也可以是这种指示也可以是选择性选择性的(如的(如TcTcS S),也可以是),也可以是非选非选择性择性的(如的(如TcTcS S, lacZ, GUSlacZ, GUS),绝大多数为后者。),绝大多数为后者。 * * *有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时,最好是选择性标记基因;
5、当完成第二作用时,目前作用时,最好是选择性标记基因;当完成第二作用时,目前多采用非选择性的多采用非选择性的检测性标记基因。有的基因是不能用作检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因(选择性标记基因(lacZlacZ,GUSGUS等)。等)。2022-5-182.2. 标记基因的种类标记基因的种类 1 1)抗性标记基因抗性标记基因(可直接用于选择转化子)(可直接用于选择转化子) a. a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Ap: Apr r ,TcTcr r ,CmCmr r,KanKanr r,G418G418r r,HygHygr r ,NeoNeor r b. b. 重金属抗性基因
6、重金属抗性基因: Cu: Cur r ,ZnZnr r ,Cd Cd r r c. c. 代谢抗性基因代谢抗性基因: TK: TK,抗除草剂基因,抗除草剂基因 2 2)营养标记基因营养标记基因(可直接用于选择转化子)(可直接用于选择转化子) 主要是参与氨基酸,核苷酸及其他必需营养物合成酶主要是参与氨基酸,核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因,类的基因, 这类基因在酵母转化中使用最频繁,如这类基因在酵母转化中使用最频繁,如TRP1TRP1,URA3URA3,LEU2LEU2,HIS4HIS4等。等。 3 3)生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应,如其表达产物可催化某些易
7、检测的生化反应,如lacZ, GUS, lacZ, GUS, CATCAT 4 4) 噬菌斑噬菌斑 2022-5-18 3.3. 使用标记基因注意要点使用标记基因注意要点 1 1)标记基因与宿主细胞)标记基因与宿主细胞 2 2)标记基因产物的作用机制)标记基因产物的作用机制: Ap: Apr r 3 3)标记基因的结构与适用范围)标记基因的结构与适用范围: : 基因启动子基因启动子, , 翻译起翻译起始序列始序列, , 密码子偏爱性密码子偏爱性 4 4)标记基因的结构变化对功能的影响)标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS: LacZ, GUS 4. 4. 常用的遗传标记基因常用
8、的遗传标记基因 1) 1) 四环素抗性基因四环素抗性基因(TcTcr r) Tetracycline Tetracycline 可结合在核糖体可结合在核糖体30s30s亚基中的一种亚基中的一种蛋白质分子上,抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因蛋白质分子上,抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种编码一种399 AAs399 AAs蛋白质,与细菌细胞膜结合,阻止四环蛋白质,与细菌细胞膜结合,阻止四环素分子进入细菌细胞。素分子进入细菌细胞。2022-5-182) 2) 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因(ApApr r) AmpicillinAmpicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合
9、成酶类的活性。可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。ApApr r抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶,催化抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶,催化内酰胺内酰胺环的环的水解水解,使氨苄青霉素失活。,使氨苄青霉素失活。3) 3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因(CmCmr r) ChlorophenicolChlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50 S50 S亚基上,阻止蛋白质合亚基上,阻止蛋白质合成。成。CmCmr r基因编码氯霉素乙酰转移酶,使氯霉素基因编码氯霉素乙酰转移酶,使氯霉素乙酰化乙酰化,导致乙酰化,导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。的氯霉素不能结
10、合在核糖体上。4) 4) 卡那霉素卡那霉素(Kan(Kanr r), ), 新霉素新霉素(Neo(Neor r) )和和G418G418抗性抗性(G418(G418r r) )基因基因 KanamycinKanamycin,NeomycinNeomycin和和G418G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素,可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子类抗生素,可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗性基因均可使这类抗生素抗性基因均可使这类抗生素磷酸化磷酸化,使之不能进入细胞,使之不能进入细胞内。内。2
11、022-5-18 5 5)半乳糖苷酶基因(半乳糖苷酶基因(lacZ lacZ 和和lacZlacZ) 半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs,基因产物不具酶活,基因产物不具酶活性,装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分:性,装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分:链和链和链。前者负责四聚体装配,后者具链。前者负责四聚体装配,后者具半乳糖苷酶活性;只有半乳糖苷酶活性;只有当两者都存在时,才会表现出酶活性,该作用称之为当两者都存在时,才会表现出酶活性,该作用称之为-互补作互补作用用。这两个部分可独立存在,。这两个部分可独立存在, 分别由两个基因编码。为分别由两
12、个基因编码。为链编链编码的基因称之为码的基因称之为lacZlacZ( (编码编码145 AAs)145 AAs)。这两个基因(。这两个基因(LacZLacZ和和LacZLacZ)均可作为标记基因。)均可作为标记基因。 半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点: : a.a. 酶催化酶催化X-GalX-Gal水解为兰色产物,检测直观水解为兰色产物,检测直观 b. lacZb. lacZ编码编码5-5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZc. lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大2022-5-18 6 6)葡萄
13、糖苷酸酶基因(葡萄糖苷酸酶基因(GUSGUS) 该基因编码一种可分解各种该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述解酶。该标记基因除具有上述lacZlacZ基因的优点外,它的适用范围十基因的优点外,它的适用范围十分广泛,因为许多生物中没有这种基因。分广泛,因为许多生物中没有这种基因。 7 7)荧光素酶基因荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶,并产荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶,并产生荧光,若在反应中加入生荧光,若在反应中加入CoACoA,可使灵敏度提高,可使灵敏度提高1010倍;或由发光细
14、倍;或由发光细菌(菌(Photobacterium fischeriPhotobacterium fischeri)产生的荧光素酶,它与)产生的荧光素酶,它与FMN-FMN-氧化氧化还原酶联用,通过还原酶联用,通过NAD(P)HNAD(P)H的变化测定酶活的变化测定酶活。 8 8)发光蛋白质基因发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质,该蛋白质可使发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质,该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。大肠杆菌菌落呈蓝色。2022-5-18 分子克隆载体的复制起点与种类分子克隆载体的复制起点与种类 1. 1. 复制起点的种类复制起点的种类 1) 1) 核内复制
15、起点核内复制起点 a. a. 染色体复制起点染色体复制起点原核生物原核生物( (环状环状) )和真核生物和真核生物( (线状线状) )染色体染色体 b. b. 染色体外复制起点染色体外复制起点 i. i. 质粒质粒DNA,RNA,DNA,RNA,线状线状, ,环状环状, ,单链单链, ,双链双链 ii. ii. 病毒病毒同上同上, , 细胞内和病毒颗粒内细胞内和病毒颗粒内 2) 2) 核外复制起点核外复制起点 a. a. 线粒体线粒体所有真核细胞所有真核细胞 b. b. 叶绿体叶绿体所有绿色植物细胞所有绿色植物细胞 原核与真核生物原核与真核生物两种质体中亦可能含有质粒两种质体中亦可能含有质粒2
16、022-5-18 3. 3. 按复制起点划分克隆载体按复制起点划分克隆载体 1) 1) 质粒复制型质粒复制型复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体 2) 2) ARSARS复制型复制型ARSARS(autonomus replicative sequence)autonomus replicative sequence),或称染色体复制型或称染色体复制型 3) 3) 病毒复制型病毒复制型复制起点来自病毒,若为复制起点来自病毒,若为RNARNA病毒,必须反病毒,必须反转录为转录为cDNAcDNA。 4) 4) 混合复制型混合复制型 a. a. 同种生物复制起点混合同种生
17、物复制起点混合质粒形式存在;质粒或病毒质粒形式存在;质粒或病毒形式存在形式存在2022-5-18 例:大肠杆菌(例:大肠杆菌(E.coliE.coli)的)的噬粒噬粒(phagemidphagemid)载体既含有来自质粒)载体既含有来自质粒的复制起点,又含有来自噬菌体(如的复制起点,又含有来自噬菌体(如M13M13)的复制起点。在不)的复制起点。在不同条件下,它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制,从而同条件下,它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制,从而获得质粒获得质粒ds- DNAds- DNA或噬菌体或噬菌体ss DNAss DNA又如:酿酒酵母(又如:酿酒酵母(Saccharomyces
18、cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae)的某些载体既含有)的某些载体既含有质粒(质粒(22)复制起点,又含有)复制起点,又含有ARSARS片段片段 b. b. 不同生物复制起点混合不同生物复制起点混合穿梭载体穿梭载体(shuttle vectorshuttle vector)两两种生物中均以质粒形式存在;在一种生物中以质粒形式存在,在另一种生物中均以质粒形式存在;在一种生物中以质粒形式存在,在另一种生物中以质粒或病毒形式存在种生物中以质粒或病毒形式存在 * * 穿梭载体范围穿梭载体范围:细菌:细菌细菌(放线菌),细菌细菌(放线菌),细菌酵母菌,酵母菌, 细菌细菌真
19、菌,细菌真菌,细菌动物动物2022-5-18分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝数的关系数的关系 1. 1. 复制起点种类与拷贝数间的关系复制起点种类与拷贝数间的关系 1) 1) 质粒复制起点类型:低拷贝(严紧型,质粒复制起点类型:低拷贝(严紧型,1-2 copies1-2 copies,受宿主,受宿主染色体基因控制);高拷贝(松弛型,染色体基因控制);高拷贝(松弛型,20 copies20 copies,受宿主染色,受宿主染色体控制较弱)体控制较弱) 2) ARS2) ARS型载体:拷贝数较高(约型载体:拷贝数较高(约20 copies20 c
20、opies) 3) 3) 病毒型复制起点:高拷贝病毒型复制起点:高拷贝 2. 2. 标记基因与拷贝数的关系标记基因与拷贝数的关系 若标记基因表达效率高,宿主细胞可能不大量产生标记基若标记基因表达效率高,宿主细胞可能不大量产生标记基因以满足选择压力要求,因而载体拷贝数会降低。对于不同标记因以满足选择压力要求,因而载体拷贝数会降低。对于不同标记基因,可采取相应方法提高其拷贝数。基因,可采取相应方法提高其拷贝数。 如:对于药物抗性标记基因,可提高药物浓度。如:对于药物抗性标记基因,可提高药物浓度。 对于营养标记基因,可降低该基因的表达效率或更换其他低对于营养标记基因,可降低该基因的表达效率或更换其他
21、低效率的标记基因效率的标记基因2022-5-18分子克隆载体的转化频率和稳定性分子克隆载体的转化频率和稳定性 1. 1. 影响转化频率的因素影响转化频率的因素 1) 1) 复制起点类型:尽可能选择高拷贝复制起点复制起点类型:尽可能选择高拷贝复制起点 2) 2) 标记基因:尽可能选择高效表达的标记基因标记基因:尽可能选择高效表达的标记基因 2.2. 影响稳定性的因素影响稳定性的因素 1)1) 复制起点类型复制起点类型低拷贝载体稳定,高拷贝载体稳定性低拷贝载体稳定,高拷贝载体稳定性差差 2)2) 选择压力选择压力 3)3) 载体在宿主细胞中的状态载体在宿主细胞中的状态自主复制型和整合型自主复制型和
22、整合型 宿主细胞的遗传特性和生理特性宿主细胞的遗传特性和生理特性2022-5-18第一节 E.coli 质粒载体一、质粒(plasmid)的一般性质1、定义 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子(Covalently closed Circular DNA, ccc DNA)2022-5-18第一节 E.coli 质粒载体一、质粒(plasmid)的一般性质2、特征n自主复制性自主复制性n质粒DNA携带有自己的复制起始区(ori)以及一个控制质粒拷贝数的基因,因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 2022-5-18第一节 E.coli 质粒载
23、体一、质粒(plasmid)的一般性质2、特征n不相容性不相容性n利用同一复制系统的不同质粒(RNAI RNAII Rop因子)如果被导入同一细胞中,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中,就会彼此竞争 ,几种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中,这就是所谓的质粒不相容性。 2022-5-18第一节 E.coli 质粒载体一、质粒(plasmid)的一般性质2、特征n可扩增性可扩增性npMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时,质粒复制能持续合成,这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时,带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制,最后每个细胞可以积聚2000-30
24、00个拷贝,这叫做氯霉素扩增氯霉素扩增。 2022-5-18第一节 E.coli 质粒载体一、质粒(plasmid)的一般性质2、特征n携带遗传标记携带遗传标记 n在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞,但是即使在最佳条件下,受体细胞中也只有少数细胞能稳定地接受质粒,要想找到这些进入了质粒的受体细胞,就要利用载体质粒上的遗传标记,天然质粒上碰巧携带许多功能基因,它们便可被用作选择标记。 2022-5-18第一节 E.coli 质粒载体一、质粒(plasmid)的一般性质3、分类 接合型和非接合型 严紧性和松弛型在基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒2022-5-18第一节 E.coli 质粒载
25、体二、质粒(plasmid)载体的构建1、理想质粒载体所具备的条件n质粒较小n质粒带有可供选择的标记n带有尽可能多的单一限制酶切位点n应有较高的基因表达能力2022-5-18第一节 E.coli 质粒载体二、质粒(plasmid)载体的构建2、质粒人工构建的目的n 天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷,因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建:(1)加入合适的选择标记基因加入合适的选择标记基因,如两个以上,易于用作选择 (2)增加或减少合适的酶切位点增加或减少合适的酶切位点,便于重组 (3)缩短长度缩短长度,切去不必要的片段,提高导入效率,增加装载量增加装载量 (4)改变复制子,变严紧为
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