分子生物学第十章-RNA干扰及其它小RNA的作用-PPT课件.ppt

1、RNA干扰及其它小干扰及其它小RNA (RNA interferenceand other small RNAs) 2006年年10月月2日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布，将员会宣布，将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学安德鲁予两名美国科学安德鲁法尔和克雷格法尔和克雷格梅洛，以梅洛，以表彰他们发现了表彰他们发现了RNA干扰现象。干扰现象。 法尔和梅洛将分享一千万瑞典克朗的奖金法尔和梅洛将分享一千万瑞典克朗的奖金(137万美元、万美元、107万欧元万欧元)。RNA干扰获得诺贝尔生理学或医学干扰获得诺贝尔生理学或医学奖奖诺贝尔奖评

2、审委员会发布的公报说：诺贝尔奖评审委员会发布的公报说： 法尔和梅洛获奖是因为他们法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信发现了控制遗传信息流动的基本机制息流动的基本机制”，这一机制为控制基因信息提供，这一机制为控制基因信息提供了基础性的依据。了基础性的依据。 公报指出，公报指出，RNA干扰已被广泛用作研究基因功能干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。病的新疗法。RNA干扰机制的发现使得科学家可以对干扰机制的发现使得科学家可以对侵入细胞的病毒侵入细胞的病毒RNA进行控制。进行控制。 诺贝尔奖评审委员会

3、指出，诺贝尔奖评审委员会指出， RNA干扰机制将来干扰机制将来有望应用于临床医学和农业等众多领域，用来开发针有望应用于临床医学和农业等众多领域，用来开发针对病毒感染、心血管疾病和癌症等的新疗法。对病毒感染、心血管疾病和癌症等的新疗法。 “我隐约觉得是有可能获奖的。但我只有我隐约觉得是有可能获奖的。但我只有45岁，所以我想或许在一二十年内才会发岁，所以我想或许在一二十年内才会发生。生。”在接受路透社采访时，马萨诸塞大学在接受路透社采访时，马萨诸塞大学教授克雷格教授克雷格梅洛梅洛(Craig Mello) 如是说。如是说。 斯坦福大学教授安德鲁斯坦福大学教授安德鲁法尔法尔(AndrewFire)

4、今年也只有今年也只有47岁。岁。 RNA干扰的发现干扰的发现 安德鲁安德鲁菲尔菲尔(AndrewZ.Fire)、克雷格、克雷格梅洛梅洛(Craig C.Mello) 1998年发现了年发现了RNA干扰和基因沉干扰和基因沉默现象。其论文发表在默现象。其论文发表在1998年年Feb 19的的NATRUE杂志上。杂志上。Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis

5、 elegans.Nature,1998,391(6669):806-811. 1998年年2月发表于英国月发表于英国自然自然杂志的一篇杂志的一篇RNA干扰论文。不少同行迅速意识到这篇论文的非凡价干扰论文。不少同行迅速意识到这篇论文的非凡价值。梅洛实验室的博士后刘棘当时在佐治亚大学攻值。梅洛实验室的博士后刘棘当时在佐治亚大学攻读博士。她清楚地记得，其导师基普里奥斯读博士。她清楚地记得，其导师基普里奥斯(EdwardKipreos)读到那篇论文时就嘀咕，读到那篇论文时就嘀咕，“这这家伙大概会获诺贝尔奖家伙大概会获诺贝尔奖”。 通常，从研究成果发表到获得诺贝尔奖，需要通常，从研究成果发表到获得诺贝

6、尔奖，需要一二十年甚至更多时间，因为成果的准确性和重要一二十年甚至更多时间，因为成果的准确性和重要性都需要科学界的反复验证。但法尔和梅洛仅仅等性都需要科学界的反复验证。但法尔和梅洛仅仅等待了待了8年，其获奖速度之快实属罕见。年，其获奖速度之快实属罕见。生理医学奖的评选程序大致为：生理医学奖的评选程序大致为： 卡罗琳医学院的诺贝尔大会任命一个工作卡罗琳医学院的诺贝尔大会任命一个工作委员会委员会诺贝尔委员会诺贝尔委员会(Nobel Committee)负负责前期工作。责前期工作。 邀请生理医学领域的代表提名候选人，提邀请生理医学领域的代表提名候选人，提名截至日期为每年名截至日期为每年2月月1日。日

7、。 诺贝尔委员会对提名进行初步筛选，然后诺贝尔委员会对提名进行初步筛选，然后候选人提交给诺贝尔大会。候选人提交给诺贝尔大会。 诺贝尔大会最终决定得主，并对外公布诺贝尔大会最终决定得主，并对外公布(一一般在每年般在每年10月份月份)。 每年每年12月月10日在斯德哥尔摩音乐厅举行颁日在斯德哥尔摩音乐厅举行颁奖仪式。奖仪式。RNA干扰的传奇故事干扰的传奇故事 中心法则中心法则 双链双链DNA 单链单链RNA 蛋白质蛋白质转录转录逆转录逆转录翻译翻译反义反义RNADNARNA蛋 白 质复 制转 录翻 译逆 转 录R N A复 制RNA干扰的传奇故事干扰的传奇故事 很早以前，就有科学家在植物中观察很早

8、以前，就有科学家在植物中观察到了基因到了基因“沉默沉默”的现象。的现象。 RNAi发现历程： 1990年，来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了： 矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！ ? ? 事实上，不但导入的基因没有表达，事实上，不但导入的基因没有表达，而且植物本身的色素合成基因也受到某种而且植物本身的色素合成基因也受到某种程度的抑制，这种现象当时称为共抑制程度的抑制，这种现象当时称为共抑制(cosuppression)。 94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制 (quelling)。 法尔和梅

9、洛则首次在线虫身上揭示，基法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因因“沉默沉默”的原因在于的原因在于RNA干扰。干扰。 实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线虫中观察到时提到，第一个在线虫中观察到(RNA干扰干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。 但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到3年后，当时在卡内基研究所供职的法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得RNA污染了微量的双链RNA，而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是RNA干扰。 郭苏目前在旧金山加州大学

10、任职。她说：“他们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞跃我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁法尔和克雷格理应获奖。” 在实验时，要认真观察每个现象，在实验时，要认真观察每个现象，发现怀疑并给予证明，不要被误导。发现怀疑并给予证明，不要被误导。 RNAi现象的普遍性现象的普遍性 随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。 RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。PlantsC. elegansDrosophilaRNA-induced silenci

11、ng complex RISCDouble stranded RNAFungiCaplen et al., PNAS (2001) 98 9742Elbashir et al., Nature (2001) 411 494MammalsS. pombeFire et al., Nature (1998) 391 806sdsRNA processingRNA interferenceNapoli et al., Plant Cell (1990) 289 Van der Krol et al., Plant Cell (1990) 2 291Small interfering RNAs (Si

12、RNAs)Romano & Macino Mol. Microbiol (1992) 6 3343Volpe et al., Science (2003) 292 1833 Misquitta & Paterson PNAS (1999) 96 1451Kennerdell & Carthew Cell (1998) 95 1017 RNA干扰（RNA interference，RNAi） 是指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。 这一现象属于转录后的基因沉默机制 (Posttranscriptional ge

13、ne silencing，PTGS)。 2006年世界科技十大新闻，2006年度诺贝尔化学与生理奖 RNA干扰（RNA interference，RNAi） 利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA,从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失表型的方法。 （课本）RNAi作用机制作用机制Ronald Plasterk. Science 2002 基因沉默基因沉默 转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)两种： TGS是指转基

14、因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默； PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。 1998年Fire等在线虫中首次发现RNAi现象以来，陆续有报导在植物和果蝇等其他各种生物中也发现了RNAi现象 但在哺乳动物细胞中，较长的dsRNA因能诱导IFN（干扰素）生成，mRNA能够发生非特异性降解，不存在特异性的RNAi现象。 但在2001年，Tuschl等报导说在哺乳动物中也存在RNAi现象，介导RNAi的中间物质是双链小RNA（Small interfering RNA，siRNA)，只要dsRNA短于30 bp，就不会促发干扰素

15、效应，能够特异性地降解靶mRNA，导致基因沉默，这一结果开辟了RNAi现象研究与应用的新领域。 RNAi的作用途径大致可分为两种： 一种是以线虫、真菌和植物为代表的RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）途径。 RNAi现象有一个靶RNA的大量产生过程，产生的靶RNA在Dicer的进一步作用下， 产生大量的siRNA，达到有效浓度的siRNA能够启动RNAi机制，降解目标mRNA； “Transitive” RNAi. Binding of siRNAs or short antisense RNAs to a targetmRNA may prime RNA sy

16、nthesis by RdRPs. The original mRNA that served as template plus the complementary RNA together form dsRNA that is recognized by Dicer and cleaved to form secondary siRNAs. RdRPs in some organisms may be able to synthesize RNA in the absence of priming. 另一种途径以果蝇和哺乳动物细胞为代表，外源或内源的双链RNA在Dicer的切割下生成siRN

17、A，这些siRNA与其他蛋白质形成RISC(RNA-induced silencing complex）结构，能够识别切割靶mRNA分子。 RNAi现象除了使生物体拥有抗病毒、稳定转座子和参与胚胎发育的生物学功能外，还可作为未知基因功能的逆向遗传学的研究手段。Mechanistic model for RNAi. dsRNA, whether endogenously produced or exogenously provided, is cleaved by the ATP-dependent RNase III-like enzyme Dicer, producing 21- to 25

18、-bp siRNAs with 2-nt 3 overhangs. Each siRNA recruits a RISC (RNA-induced silencing complex）, which unwinds the siRNA, exposing each strand for potential binding to complementarytarget sequences. When the now-activated RISC (RISC*) binds to a target mRNA, it cleaves it at a site approx 10 bp from th

19、e 5 end of the siRNA. This results in twocleavage products, one missing its polyA tail and the other its 5 7-methyl guanosine cap, making each vulnerable to additional degradation by mRNA surveillance machinery. Meanwhile, the activated RISC is free to target additional messages. dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过

20、程分为两步: 第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶切割加工成21-23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。 RNAi作用机制作用机制Ronald Plasterk. Science 2002 不同的生物中不同的生物中Dicer的种类、数量也不同的种类、数量也不同至今在哺乳动物中仅发现了一种至今在哺乳动物中

21、仅发现了一种Dicer还未找到调节还未找到调节Dicer功能的蛋白质功能的蛋白质RNase III 样酶样酶RdRP(RNA-dependent RNA polymerase)最早是在一些非逆转录最早是在一些非逆转录RNARNA病毒中发现病毒中发现以单链以单链RNARNA为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成双链为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成双链RNARNA在西红柿、拟南芥、线虫在西红柿、拟南芥、线虫 等均发现其同源物，均参与了等均发现其同源物，均参与了RNAi在真核生物中未发现有特别的功能在真核生物中未发现有特别的功能在果蝇、人未发现其同源物，但存在有发挥其作用的替代物在果蝇、人

22、未发现其同源物，但存在有发挥其作用的替代物具有识别不同具有识别不同RNARNA的能力，起到的能力，起到“sensor”sensor”的作用的作用The “core” RNA-silencing response involves processing of the trigger dsRNA into smaller 21- to 25-bp fragments with dinucleotide 3 overhangs by an adenosine triphosphate (ATP)-dependent enzyme named Dicer . Dicer encodes a multi

23、domain protein containing an ATP-dependent RNA helicase, PAZ domain, two tandem RNase III domains, and a dsRNA-binding domain. The 21- to 25-bp products of Dicer activity are referred to as short interfering RNAs (siRNAs), which are thought to serve as “guides” to bring nuclease machinery to the tar

24、get mRNA: each siRNA associates with a protein complex called RNA-induced silencing complex (RISC), and presumably the siRNA is unwound by a helicase component of RISC to allow base pairing between the antisense strand and the target mRNA . Such base pairing leads to endonucleolytic cleavage of the

25、target mRNA, producing one fragment missing its polyA tail and the other missing its 5 7-methylguanosine cap, leaving each segment vulnerable to further degradation by RNA surveillance machinery. Following cleavage, it is thought that the siRNA/RISC complex becomes available to target another messen

26、ger molecule。RISC(RNA-induced Silencing Complex)mRNA解旋酶解旋酶核酸内切酶核酸内切酶Argonaute proteinsiRNA？250KD (inactive)100KD (active)ATPRISC包含包含siRNA中的一条链中的一条链RISC(RNA-induced Silencing Complex)mRNA解旋酶解旋酶核酸内切酶核酸内切酶Argonaute proteinsiRNA？250KD (inactive)100KD (active)ATPRISC包含包含siRNA中的一条链中的一条链 RNAi途径主要存在于细胞浆中，但是

27、siRNA产生、靶mRNA降解的亚细胞位置尚未明确。 外源性（注射或喂养）的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接进入细胞浆中的RNAi途径，仅在细胞浆中复制的RNA病毒可被dsRNA介导的沉默机制所抑制 外源性dsRNA则还可导致细胞核中的同源早期RNA转录产物减少。 Brenda Bass. Nature 2001长长dsRNA在哺乳动物细胞会引起非特异性反应在哺乳动物细胞会引起非特异性反应长长dsRNA引起非特异性反应的途径引起非特异性反应的途径 Phillip Sharp et al. Nature Reviews 2002 siRNA(small interfering RNA)

28、P-AGUCCGUAACUGACUACGCUU-OHOH-UUUCAGGCAUUGACUGAUGCG-P553321-23 nt siRNAThomas Tuschl et al，Nature 2001-GUGAACAUCACGUACGCGGAAUACUUCGAAAUGUC- 5 CGUACGCGGAAUACUUCGAUU UUGCAUGCGCCUUAUGAAGCU 5切割位点切割位点siRNA 双链双链靶靶mRNAThomas Tuschl etc. Cell 2002 在许多机体中反向重复转基因序列在细胞核内转录成发夹dsRNA，进而可介导RNAi，这种dsRNA可能需要转移至胞浆中才可有

29、效地沉默同源靶mRNA。 如在果蝇中，转录含有内含子和多聚腺苷酸信号的发夹dsRNA的反向重复转基因序列比转录不含内含子、不含多聚腺苷酸信号dsRNA的转基因序列更能有效地沉默同源靶mRNA（因为内含子和多聚腺苷酸信号有利于dsRNA转移入胞浆）。 另外，内源性的小的短暂RNA（small temporal RNA，stRNA，为一种修饰后的miRNA）也可作为siRNA发挥基因沉默作用。 stRNA（miRNA）是约70nt发夹RNA（发夹miRNA 前体，miRNA hair precursor）被RNase样核酸酶切割加工成的单链22nt RNA。由于stRNA与靶基因不完全互补，它从翻

30、译水平阻抑基因表达。 除上述RNAi机制外，转基因真核生物中的dsRNA尚可引起相应基因的甲基化和染色质重构、凝集、异染色质化，基因甲基化和异染色质化还可能促使异常RNA（aberrant RNA）产生，最终导致基因沉默。RNAiRNAi的放大效应机制的放大效应机制 siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。 新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。 次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。 这种合成-切割的循环过程称为随机降

31、解性PCR（random degradative PCR）。RNAi 的特点的特点转录后水平的基因沉默较高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。其它小RNAs及其作用 MicroRNAs (miRNAs): 是一种大小约2123个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。 据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参

32、与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。 第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。Micro RNAsPasquinelli et al., Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature (2000) 408 86Hutvgner et al., A Cellular Function for the RNA-Int

33、erference Enzyme Dicer in the Maturation of the let-7 Small Temporal RNA. Science (2001) 293 834 Micro RNAs originally identified in C. elegans as non-coding RNAs of 22 nts processed from a precursor RNA of 80 nts with a defined hairpin structure. The 22 nt RNA species (Let 7) was required for devel

34、opmental timing through interaction with another transcriptSubsequently there was evidence for a role for Dicer protein in pre-let-7 processing in vitro and in vivo. miRNA 的特征: 大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5端磷酸基和3羟基，大小约21-25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3端或者5端。 miRNAs的表达方式各不相同: 部分线虫和果蝇的mi

35、RNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达， 而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。 miRNA的功能 对microRNAs (miRNAs)的研究正在不断增加，原因是科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征 在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种m

36、iRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。 第一个被确认的miRNA在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3非编码区(3UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程。 bantam miRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。 除了lin-4、let-7，已知还有一些miRNAs可能参与在细

37、胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23 等。 在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs可能参与植物的发育过程。 一是在carpel factory (car) 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。 CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。 实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。 对一部分miRNAs的研究分析提示： miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，

38、包括早期发育(Reinhart 2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代谢（Xu 2003)和细胞分化(Kawasaki 2003)。 此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin 2002)。 由于miRNAs存在的广泛性和多样性，提示miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。 尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。 有一种看法是：miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调

39、控方式。 然而，大多数miRNAs的功能仍然是个谜。 miRNA和siRNA的关系 miRNA和siRNA之间的关系从表面上说，一个是非编码的单链小分子RNA，在进化上高度保守，通过翻译抑制调控基因表达而不影响转录本的稳定性；另一个是针对编码区的双链小分子RNA，每个转录本都可能有很多个siRNAs，是通过降解目标靶，在转录后调控基因表达。 由于每个mRNA模版可能产生很多个siRNAs，要给每个siRNA定一个基因的名字就很困难。miRNA是进化进程中高度保守的，因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能，而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容易造成混乱。 然而，据推测

40、miRNAs通常是由较大的（70-90 nt）的茎环结构（发夹结构）前体经Dicer酶切割得到的，而Dicer同样负责将长双链RNA切割为siRNA，而且二者的长度也差不多，同样有调控基因表达功能。 因而这两类小分子RNA之间的关系格外令人关注。 在哺乳动物细胞中还没有找到内源的siRNA，外源的siRNA介导的RNAi作用正是一种抵御机制。 而miRNAs则广泛存在于哺乳动物细胞中，从理论上推测可能参与多种调控作用。 这两种小东西的作用机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成为一个值得关注的问题。 未来要解决的问题 mi

41、RNAs在多个物种中广泛被发现，而且在进化上高度保守。 留给我们一大堆谜团： miRNA的确切功能是什么？ 它的目标靶是什么？ 作用机制是什么？ 正如Phillip Zamore说的：“如果miRNAs在进化的进程中如此高度保守而没有任何实际功能，那真是大自然拿科研人员开涮而且是一个残酷的玩笑”。 研究miRNA的新工具 随着小分子RNA日益收受到研究人员的重视，很多研究小分子RNA的新方法不断推出。siRNA与miRNA作用位置不同： 对于siRNA（small interfering RNAs）而言，mRNA就是target,而且一般推荐设计siRNA时不能包含UTR区。其他的地方就可以笼

42、统地叫off-target,靶之外. 对于miRNA（microRNAs）而言，3UTR区就叫target，而mRNA的CODING REGION就是off-target。MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms - Zeng et al_ 100 (17) 9779 - Proceedings of the National Academy of SciencesSaxena S, Jonsson ZO, Dutta A. Small RNAs with imp

43、erfect match to endogenous mRNA repress translation. Implications for off-target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells.J Biol Chem. 2003 Nov 7;278(45):44312-9. Epub 2003 Sep 2. piRNAs简介 如果piRNAs研究趋势与microRNAs相似的话，那么生物界将会由这些从事piRNA未知领域研究的科学家们带来一股研究新浪潮。 洛克菲勒大学的Thomas Tuschl （ piRNAs的发现为2

44、006年世界生物10大发现之一）piRNA简介 来自冷泉港实验室的Gregory Hannon研究小组和纽约洛克菲勒大学的Thomas Tuschl研究小组的研究人员发现了数千种不同的哺乳动物小分子RNA的一个新成员piRNAs（Piwi-interacting），该种小RNA在小鼠精子发育中普遍存在，并起到了重要作用。 这一研究成果公布在2006/6月4日的Nature网络版。 自2000年RNA研究进展被Science杂志评为年度重大科技突破之后，2001年的RNAi，2002年的“Small RNA & RNAi”，以及2003年的小核糖核酸都相继在重大科技成就上榜上有名。 RNA研究风

45、声水起，就连在DNA的传递遗传物质和蛋白的执行功能这些“专长”方面也发现是由RNA最初具有的。 piRNA，即Piwi-interacting nucleotides 在之前的发育精子研究中就发现其对于合子的形成的复杂过程中势必可少的，但是它们的功能和起源仍然是不清楚的; 研究人员主要的研究对象是来自无脊椎动物和小鼠中研究精子细胞发育过程中起重要作用的Piwi蛋白这些蛋白分子组成了Argonaute家族蛋白的一个结构域，microRNA靶向Argonaute蛋白标志来使基因沉默。 两个研究小组都分别对能与小鼠睾丸组织包含Piwi蛋白的核蛋白复合体免疫共沉的RNA进行了纯化、克隆和测序。其中Tu

46、schl和他的同事们的实验利用了Piwi蛋白的同源蛋白MILI蛋白，而冷泉港实验室的Gregory Hannon则利用MIWI进行实验。 结果两个研究小组都在他们的免疫共沉淀试验中发现了21-23核苷酸长度的RNA分子。Hannon小组的Northern印迹分析显示这些单链RNA与Piwi相连，而不是与其它Argonaute蛋白相连。两个研究小组将这些RNA称作Piwi-interacting nucleotides或者piRNA，并且发现与MIWI相比，MILI与稍微小一点的piRNA相结合。 两个小组发现大概90%的piRNA序列以尿嘧啶开始，与其它的小RNA分子的特点一样。 Hannon

47、和他的同事们在小鼠睾丸中发现了52,934种候选piRNAs，在人类中发现了52,099种，而在老鼠中发现了47,024种。在这些物种中，大部分piRNAs成簇形成相对少量的基因座（loci），小鼠中大约形成100个主要的基因簇。这种成簇现象表明大量的piRNA由长距离转录加工而成。 与microRNAs和siRNAs不一样，piRNAs来源于单链RNA前体（precursor）而不是双链RNA前体。Tuschl和他的同事们认为，与近亲老鼠的基因组比较，小鼠的piRNA序列保守性良好，但是与遗传距离较远的物种相比，保守性较差。 尽管如此，大部分小鼠的piRNA簇能在人和老鼠染色体上相同的位置找

48、到。“它们就好象是染色体上某类基因的划分地界线。这强有力的说明它们可能与染色体生物学有关。” Hannon说。 PiRNAs在人内出现的丰度比小鼠小，假设piRNAs的功能是识别互补的信使RNA，也许人的RNA结合蛋白则代替了一些piRNAs的功能。 RNA结合蛋白是人类基因组中最大种类的蛋白之一。两个研究小组利用northern blotting分析发现piRNAs出现在小鼠的精子细胞中，尤其是在减数分离开始时大量积聚，在成熟的精子产物中消失。 “我们仅能在人类和小鼠的睾丸中发现piRNAs，它们也许在卵子的发育过程中也有表达，”Tuschl说。 “在精子细胞的减数分裂结束前，我们发现了基因

49、转录的爆发，而在基因转录爆发前有巨大的、迅速的piRNAs最终爆发。” 来自底特律韦恩州立大学的Stephen Krawetz说。“有趣的是会看到piRNAs是否参与转录的调节或者RNA的存储。” 来自杜克大学综合癌症中心干细胞与生殖发育实验室（Laboratory of Stem Cells and Germline Development）主任林海帆教授领导的研究小组在之前研究的基础上，发现了在精子形成过程中大量表达的非编码小RNAPIWI-interacting RNAs (piRNAs)，这说明在胞质核蛋白（cytosolic ribonucleoprotein）和多核糖体片段（pol

50、ysomal fractions）中MIWI与piRNAs，以及mRNA有关联。这一研究成果公布在8月24日美国国家科学院院刊PNAS杂志上。 之前冷泉港实验室及洛克菲勒大学的研究人员发表在6月4日的Nature网络版上提出了piRNAs的概念，他们发现了数千种不同的哺乳动物小分子RNA的一个新成员piRNAs（Piwi-interacting），该种小RNA在小鼠精子发育中普遍存在，并起到了重要作用。 Lin实验室在之前的文章中报道过MIWI这种鼠科PIWI家族成员在精子最初形成时是必须的精子形成是一个round spermatids发育成成熟精子的过程。进一步他们发现在早期精子形成的过程中