胚胎体外培养和胚胎评估的培训PPT培训课件.ppt
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1、胚胎体外培养和胚胎体外培养和胚胎评估的培训胚胎评估的培训胚胎体外培养胚胎体外培养胚胎评估胚胎评估空气、振动、光照空气、振动、光照培养箱外环境培养箱外环境人员人员/ /操作操作培养流程培养流程alarmi iauto-auto-startstart O2 CO2cal90auto-startdoor90hl培养箱内环境培养箱内环境气体、气体、 湿度、培养湿度、培养皿、油皿、油培养液培养液胚胎体外培养体系胚胎体外培养体系培养箱外环境培养箱外环境 空气及污染物空气及污染物 振动、噪音振动、噪音 光照光照 室内湿度室内湿度挥发性有机化合物挥发性有机化合物VOC总挥发性有机化合物(总挥发性有机化合物(T
2、VOC):):熔点低于室温熔点低于室温沸点沸点50260挥发性有机化合物的总称挥发性有机化合物的总称世界卫生组织(WHO,1989) VOC分类分类 苯系物(苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯)苯系物(苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯) 二异氰酸酯(二异氰酸酯(TDI) 二异氰甲苯酯二异氰甲苯酯 有机氯化物(三氯乙烯、三氯甲烷、三有机氯化物(三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷)氯乙烷) 氟里昂类氟里昂类 石油烃类石油烃类 有机酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等有机酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等测定测定VOC 先俘获、后测定先俘获、后测定 各种各种VOC的俘获方法不同的俘获方法不同 测定总测定总VOC? 目前测定的目前测定的“
3、TVOC”:613个碳原子个碳原子的苯系有机物的苯系有机物 其他其他VOC有各自的俘获测定方法有各自的俘获测定方法未知未知VOCVOC很难测定很难测定尘埃粒子尘埃粒子 直径直径0.5um的悬浮粒子的悬浮粒子 十万级:十万级:3500000/m3 万级:万级:350000/m3 千级:千级:35000/m3光照光照 来源:室内照明灯、显微镜光源来源:室内照明灯、显微镜光源 危害:危害: 损害线粒体损害线粒体 培养液成分分解培养液成分分解 紫外线产生活性氧,对所有细胞有害紫外线产生活性氧,对所有细胞有害光照光照 豚鼠卵,超过一小时,影响后续受精和豚鼠卵,超过一小时,影响后续受精和有丝分裂有丝分裂
4、低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠 有相反的结论有相反的结论兔卵进行光照兔卵进行光照2030分钟后,随后的受精率和着床率并未受分钟后,随后的受精率和着床率并未受到明显影响到明显影响相对湿度(相对湿度(RH)RH=绝对湿度绝对湿度/饱和湿度饱和湿度RH=43.5%RH=33.3%理想的室内相对湿度?理想的室内相对湿度?设备设备抑制霉菌抑制霉菌人员人员减少液体蒸发减少液体蒸发01003060%培养箱内环境培养箱内环境 气体气体 温度温度 培养皿培养皿 液滴液滴 培养方式培养方式 油油气体气体二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱CO2alarmi iauto-auto-starts
5、tart O2 CO2cal90auto-startdoor90hl三气培养箱三气培养箱桌面式培养箱桌面式培养箱N2气体纯度气体纯度 99.99%? 99.995%? 99.999%?剩余的0.001%是什么?CO2 高浓度氧,胚胎基因表达异常?高浓度氧,胚胎基因表达异常? 低氧培养改善体外胚胎发育低氧培养改善体外胚胎发育 低氧培养,人囊胚细胞数增加低氧培养,人囊胚细胞数增加低氧培养低氧培养低氧培养低氧培养 部分文献部分文献不必要低氧不必要低氧? 培养液内,添加了抗氧化物质(牛磺酸、培养液内,添加了抗氧化物质(牛磺酸、丙酮酸)丙酮酸) 可能消除高氧的不利影响可能消除高氧的不利影响maxmin%
6、CO2%rHdesautozeroauto-startcontrolidesstart/stopIOASRM,2013年年支持低氧环境利于囊胚形成!支持低氧环境利于囊胚形成!低氧同样利于卵裂期胚胎低氧同样利于卵裂期胚胎Low oxygen concentrations for embryo culture in assisted reproductive technologiesStephan Bontekoe1,*, Eleni Mantikou1, Madelon van Wely1, Published Online: 11 JUL 2012Assessed as up-to-date:
7、 4 NOV 2011DOI: 10.1002/14651858.CD008950.pub2 荟萃分析,随机对照研究 1382 名IVF/ICSI患者 20% vs 5% O2 活产率从32%提高到43%温度温度 鼠胚鼠胚 室温室温5分钟分钟降低卵裂率降低卵裂率 15分钟分钟囊胚形成率减半囊胚形成率减半 人卵母细胞人卵母细胞低温损害纺锤体低温损害纺锤体温度温度纺锤体解聚与恢复纺锤体解聚与恢复 33下,下,5分钟解聚,分钟解聚,10分钟完全消分钟完全消失失37后后, 10分钟内恢复分钟内恢复 28,解聚加快,恢复时间长,解聚加快,恢复时间长,20分钟不能完全恢复分钟不能完全恢复液滴液滴/培养方式
8、培养方式 单独培养单独培养集合培养集合培养 胚胎自分泌、旁分泌作用胚胎自分泌、旁分泌作用 减小体积减小体积 适当增加胚胎数目适当增加胚胎数目液滴自分泌自分泌旁分泌旁分泌集合培养集合培养依据依据 鼠、羊、牛胚胎培养证据鼠、羊、牛胚胎培养证据 具体旁分泌因子未确定具体旁分泌因子未确定集合培养集合培养方法方法 2050ul 25个胚胎个胚胎/液滴液滴 盖油(石蜡油、矿物油)盖油(石蜡油、矿物油)液滴矿物油矿物油液滴液滴集合培养集合培养缺点:不利于单个胚胎的连续观察缺点:不利于单个胚胎的连续观察解决解决1 1:按:按Day3Day3形态学评分分组培养形态学评分分组培养8细胞碎片0108细胞碎片2040
9、6细胞碎片2050解决解决2 2:特殊培养皿特殊培养皿液滴培养液培养液 培养液种类培养液种类 水、离子水、离子 碳水化合物碳水化合物 氨基酸氨基酸 pH值及缓冲物质值及缓冲物质 维生素,抗生素维生素,抗生素 螯合剂螯合剂 抗氧化物质抗氧化物质 蛋白质,大分子蛋白质,大分子 激素,生长因子激素,生长因子培养液种类培养液种类 序贯培养液序贯培养液 单一培养液单一培养液序贯培养序贯培养mmol/LGardner,1998序贯培养序贯培养 葡萄糖葡萄糖 不利于分裂期胚胎发育不利于分裂期胚胎发育 囊胚主要能量来源囊胚主要能量来源 EDTA 利于分裂期胚胎发育利于分裂期胚胎发育 抑制囊胚内细胞团发育抑制囊
10、胚内细胞团发育 氨基酸氨基酸序贯培养系统序贯培养系统 Day1Day3:卵裂期培养液卵裂期培养液 Day3Day6:囊胚培养液:囊胚培养液单一培养液?单一培养液? 单一培养:简化流程,形成率类似单一培养:简化流程,形成率类似 Day3换液换液 Day3不换液!不换液!pH值与缓冲物质值与缓冲物质 pH:代表氢离子浓度:代表氢离子浓度 pH与细胞各种生理功能关系极密切与细胞各种生理功能关系极密切 pH指示剂:酚红指示剂:酚红缓冲物质:维持缓冲物质:维持pH稳定,成对或一种稳定,成对或一种:碳酸盐缓冲对、:碳酸盐缓冲对、MOPS、HEPES1pH值值147pH值与值与CO2浓度浓度 最重要的缓冲对
11、最重要的缓冲对 碳酸盐缓冲对:碳酸盐缓冲对:HCO3-/H2CO2培养系统的培养系统的pH值值 7.2-7.4 碳酸盐体系不稳定!碳酸盐体系不稳定! 暴露空气会使暴露空气会使PH迅速升高迅速升高 盖油减少培养基气体交换盖油减少培养基气体交换CO2浓度影响因素浓度影响因素 设定值:设定值:5%?6% 传感器类型传感器类型 培养箱开门方式培养箱开门方式 温度、湿度温度、湿度 无机离子参与渗透压形成无机离子参与渗透压形成 高浓度氯化钠不利于鼠囊胚形成高浓度氯化钠不利于鼠囊胚形成 胞外镁和钙的水平与早期胚胎细胞对细胞外镁和钙的水平与早期胚胎细胞对细胞内稳态调节能力有关胞内稳态调节能力有关 磷在含有葡萄
12、糖的简单培养基例如磷在含有葡萄糖的简单培养基例如HTF或或Earls抑制抑制人胚胎的发育人胚胎的发育无机离子无机离子 铵铵 氨基酸代谢及自然分解产生的氨会导致氨基酸代谢及自然分解产生的氨会导致胚胎毒性物质胚胎毒性物质-铵离子的积累铵离子的积累 铵离子可以改变胚胎分化、代谢及基因铵离子可以改变胚胎分化、代谢及基因表达表达 会严重降低移植后种植率及胎儿发育率会严重降低移植后种植率及胎儿发育率抗生素抗生素 培养基中一般均含抗生素例如青霉素、培养基中一般均含抗生素例如青霉素、链霉素和庆大霉素链霉素和庆大霉素 主要作用时防止培养基的细菌污染主要作用时防止培养基的细菌污染蛋白质蛋白质/大分子物质大分子物质
13、 白蛋白白蛋白可以降低配子和胚胎表面电荷,可以降低配子和胚胎表面电荷,避免其粘到玻璃或塑料上便于操作,且避免其粘到玻璃或塑料上便于操作,且可以抵消毒性效应可以抵消毒性效应如:人血清蛋白(如:人血清蛋白(HSA)和牛血清蛋白、)和牛血清蛋白、人血浆蛋白粉、人血浆蛋白粉、5%血浆蛋白注射液、及合血浆蛋白注射液、及合成血清替代品(成血清替代品(sss) 阻止培养液的蒸发及培养基阻止培养液的蒸发及培养基pH的变化的变化 种类:种类:矿物油矿物油石蜡油石蜡油油油培养液储运培养液储运 冷链运输,冷链运输,28 保持容器密封,有泄漏的容器导致培养保持容器密封,有泄漏的容器导致培养液碱化,镁离子沉淀液碱化,镁
14、离子沉淀 减少细菌污染风险减少细菌污染风险分装分装 目的:减少开瓶次数目的:减少开瓶次数 分装量:根据使用情况,一次一支分装量:根据使用情况,一次一支 分装容器,与量匹配分装容器,与量匹配 标记分装日期标记分装日期胚胎移植移植时期胚胎移植移植时期 广泛采用广泛采用D3(约(约8-cell)胚胎移植)胚胎移植 在体内此时的胚胎是在输卵管内,而不是在在体内此时的胚胎是在输卵管内,而不是在子宫内子宫内 卵裂期移植的妊娠率卵裂期移植的妊娠率低于低于D4及囊胚移植及囊胚移植囊胚培养囊胚培养 进一步筛选胚胎进一步筛选胚胎 灵活的移植时间灵活的移植时间 便于便于PGD/PGS 减少异位妊娠减少异位妊娠囊胚的
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