SDS-PAGE蛋白凝胶电泳PPT幻灯片课件.ppt

1、12配胶配胶样品制备样品制备电泳（电泳（1.52h）染色（染色（20min）脱色（脱色（30min2h）分析分析配分离胶配分离胶(下胶下胶)配浓缩胶配浓缩胶(上胶上胶)3BG-verMINI型迷你垂直电泳槽型迷你垂直电泳槽 (北京百晶北京百晶)42.2.凝胶配制凝胶配制 * *AcrAcr有神经毒有神经毒 性性5凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速, 催化剂催化剂TEMED要在注胶前再加入要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡避免产生气泡.1cm下胶高度，距齿下1cmAB 水封平齐，排气泡平齐，排气泡加速聚合加速聚合C弃水

2、层弃水层凝固凝固D灌上胶，插梳子梳需平稳插入梳需平稳插入,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡,梳底需水平梳底需水平6出现明显界面时，出现明显界面时，分离胶凝聚完成分离胶凝聚完成（ 1020min）倒出水或正丁醇，倒出水或正丁醇，并用加样枪并用加样枪/ /滤纸滤纸吸干吸干v制备分离胶制备分离胶(下胶下胶) 封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。7加入浓缩胶溶加入浓缩胶溶液液 pH 6.8pH 6.8v制备浓缩胶制备浓缩胶(浓缩胶浓缩胶)样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入, ,梳梳口处不得有气泡口处不得有气泡, ,梳底需梳底需水平。水平。插入样

3、品梳插入样品梳81. 1. SDS2. 2. - mercaptoethanol 3. 3. bromophenol blue4. 4. GlycerolSample buffer样品处理样品处理ssSHSH金属金属浴浴(100)中中15minSample buffer9A. 样品加热，上样样品加热，上样B. 电泳电泳+（1）上胶）上胶 恒压恒压80V (8V/cm)（2）下胶）下胶 恒压恒压120V (12V/cm)10v上样及电泳上样及电泳11Staking gelSeparating gel12负极负极正极正极内槽内槽外槽外槽凝胶凝胶外槽外槽13A. 染色染色20分钟分钟B. 脱色30分

4、钟至2小时考马斯亮兰考马斯亮兰R2501415CH2CHCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O( )nCH2CHCNH2O( )nCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O( )nCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O( )nCH2CHCNH2O( )n+* *AcrAcr有神经毒有神经毒 性性n决定了交联度与浓度一起决定孔径的大小过硫酸铵是催化剂TEME

5、D是加速剂蛋白质是29：1核酸是19：11617Cl-Gly-Cl-Gly-Cl-Gly-PH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-主要离子主要离子氯离子氯离子甘氨酸离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子蛋白质离子Gly-Gly-Pr-Pr-Pr-PH8.818加加 样样 缓缓 冲冲 液液二硫键二硫键盐键盐键疏水作用疏水作用氢键氢键巯基乙醇巯基乙醇断二硫键断二硫键SDSCH3SO4Na断化学键断化学键带负电荷带负电荷甘油甘油SDS：Pr=1.4:1NC氨基酸侧链氨基酸侧链SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-促沉促沉溴酚兰溴酚兰Tris?19Cl-C

6、l-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子主要离子氯离子氯离子甘氨酸离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子蛋白质离子Pr-Pr-Pr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.8快慢离子的产生快慢离子的产生高的电压梯度高的电压梯度Pr-运动加速运动加速20Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子主要离子氯离子氯离子甘氨酸离子甘氨酸离子 (pI 5.97)蛋白质离子蛋白质离子Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.85%10%快慢离子的产生快慢离子的产生高的电压梯度高的电压梯度Pr-运动加速运动加速浓缩效应浓缩

7、效应2122pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子主要离子氯离子氯离子甘氨酸离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加甘氨酸解离增加无快慢离子无快慢离子Pr-根据分子量运动根据分子量运动分子筛效应分子筛效应Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-23pH6.8主要离子主要离子氯离子氯离子甘氨酸离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加甘氨酸解离增加无快慢离子无快慢离子Pr-根据分子量运动根据分子量运

8、动分子筛效应分子筛效应Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-24pH6.8pH8.85%10%lgMw电泳迁移率lgMw=-bx+KPr Mw在11.7-165Kd25pH6.8pH8.85%10%迁移率迁移率=蛋白质移动的距离蛋白质移动的距离脱色后的胶长脱色后的胶长染色前胶长染色前胶长指示剂移动的距离指示剂移动的距离26迁移率迁移率=“蛋白质移动的距离蛋白质移动的距离”指示剂移动的距离指示剂移动的距离染色前染色前染色后染色后蛋白质的带在哪呢？蛋白质的带在哪呢？L1L2L3L4LxL1 X L3L2 X L

9、427PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.281. 采用此法测蛋白质分子量时，必须完全打开二硫键。采用此法测蛋白质分子量时，必须完全打开二硫键。2. 多亚基蛋白问题多亚基蛋白问题3. 有些蛋白质不能用有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白

10、，如胶原蛋白等。（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。29309766442920143132IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白（31.9kD）。1为诱导前，26分别为诱导0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。 33电泳过程中的不正常现象电泳过程中的不正常现象1 “微笑”现象指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。342 皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

11、 353 “拖尾”现象样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大 解决办法：加样前离心选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液加增溶试剂降低凝胶浓度364 “纹理”现象样品中的不溶性颗粒引起的解决办法：增加溶解度离心除去不溶性颗粒375 偏斜现象电极放置不平行或加样位置偏斜引起386-2 整块胶分离的条带太宽主要是未浓缩好的原因 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确 （6.7） ；适当降低电压； 6-1 某一条泳道条带太宽加样量太多或者加样孔泄露引起397. “鬼带” “鬼带”就是在跑大分子、构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉

12、淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性， WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法： 在加热煮沸后， 再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇， 以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。 404142434445461. BCA法bicinchoninic acid二奎啉甲酸法472. lowry法 folin酚法 磷钨酸和磷钼酸 钨蓝、钼蓝BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍 0.005 - 0.10 mg/ml 48495051