蛋白质芯片技术ppt课件.ppt

1、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术1一一 蛋白质芯片技术产生的背景蛋白质芯片技术产生的背景二二 蛋白质芯片的概念蛋白质芯片的概念三三 蛋白质芯片的主要特点蛋白质芯片的主要特点四四 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类五五 蛋白质芯片技术的简要操作步骤蛋白质芯片技术的简要操作步骤六六 蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用2 随着人类和其他生物的全基因组序列的随着人类和其他生物的全基因组序列的完成，人们开始认识到基因仅仅是生物体遗完成，人们开始认识到基因仅仅是生物体遗传信息的载体，而生命活动的执行者、表观传信息的载体，而生命活动的执行者、表观性状的体现者则由基因编码的产物性状的体现者则由基因编码的产物蛋白质蛋白

2、质所行使。基因只是一种编码，由它指导细胞所行使。基因只是一种编码，由它指导细胞合成蛋白质，而几乎所有的生物化学反应均合成蛋白质，而几乎所有的生物化学反应均发发 生在复杂的蛋白质分子之间或有蛋白质生在复杂的蛋白质分子之间或有蛋白质参与，所有的外在表现均由种类繁多的参与，所有的外在表现均由种类繁多的蛋白蛋白质质所决定。所决定。3 随着分子生物学技术的发展，生物芯随着分子生物学技术的发展，生物芯片技术研究工作不断深入，片技术研究工作不断深入，DNADNA芯片技芯片技术被逐渐用于对生物样品中核酸序列术被逐渐用于对生物样品中核酸序列表达的检测和比较研究。表达的检测和比较研究。 随着随着DNADNA芯片技

3、术的不断成熟，以及基芯片技术的不断成熟，以及基因研究所取得的令人瞩目的成果，进因研究所取得的令人瞩目的成果，进一步推动一步推动蛋白质功能的研究及相关技蛋白质功能的研究及相关技术的发展术的发展，蛋白质芯片技术因此应运蛋白质芯片技术因此应运而生而生。4蛋白质芯片蛋白质芯片是将各种微量纯化的蛋白质是将各种微量纯化的蛋白质阵列在一种高密度的固相载体上，并与阵列在一种高密度的固相载体上，并与待测样品杂交，以测定相应蛋白质的性待测样品杂交，以测定相应蛋白质的性质、特征以及蛋白质与生物大分子之间质、特征以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用的方法。的相互作用的方法。51.1.高通量高通量2.2.灵敏度较高灵敏

4、度较高3.3.重复性好重复性好4.4.操作自动化操作自动化6u按蛋白质性质分类按蛋白质性质分类1.1.无活性芯片：无活性芯片：将已经合成好的蛋白质以高密度阵将已经合成好的蛋白质以高密度阵列点样在芯片上，进行杂交反应。列点样在芯片上，进行杂交反应。2.2.有活性芯片：有活性芯片：把生物体直接点在芯片上，并原位把生物体直接点在芯片上，并原位表达蛋白质。表达蛋白质。u按形式分类按形式分类1.1.玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建）玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建）2.2.3-D3-D胶芯片（在多孔凝胶垫上构建）胶芯片（在多孔凝胶垫上构建）3.3.微孔芯片（在微孔板上构建）微孔芯片（在微孔板上构建）7类别类

5、别特点特点玻璃表面构建的玻璃表面构建的蛋白质芯片蛋白质芯片可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；很容易蒸发；不适合用于多步反应；造价便很容易蒸发；不适合用于多步反应；造价便宜；容量较小；容易发生交叉污染宜；容量较小；容易发生交叉污染多孔微胶垫上构多孔微胶垫上构建的蛋白质芯片建的蛋白质芯片可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；不易蒸发；可以用于多步反应，不易蒸发；可以用于多步反应，但是有其较但是有其较固定的缓冲条件；造价昂贵；固定的缓冲条件；造价昂贵；容量较大；不容量较大；不易发生交叉污染易发生交叉污染微孔板上构

6、建的微孔板上构建的蛋白质芯片蛋白质芯片可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；不易蒸发；适用于多步反应；造价便宜；容不易蒸发；适用于多步反应；造价便宜；容量较大；不易发生交叉污染量较大；不易发生交叉污染8操作步骤操作步骤提出生物学问题提出生物学问题（实验目的）（实验目的）样品预处理样品预处理（重组蛋白，制备一、二级抗体，重组蛋白，制备一、二级抗体，荧光标记，配蛋白印记缓冲液）荧光标记，配蛋白印记缓冲液）生化反应生化反应化学偶合，加底物，化学偶合，加底物，反应温度和时间，反应温度和时间，冲洗条件冲洗条件检测检测（荧光和比色扫描或拍照，（荧光和比色扫描或拍照

7、，参数设置）参数设置）数据分析和建模数据分析和建模（图象量化，标准化，图象量化，标准化，采集蛋白信息，建立模型）采集蛋白信息，建立模型）3 3蛋白质芯片制备蛋白质芯片制备6 61 19一一 固相载体及其处理固相载体及其处理载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）二二 蛋白质的预处理蛋白质的预处理选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解三三 点制微阵列点制微阵列可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等四四 固定微阵列上的蛋白样点固定微阵列上的蛋白样点膜为载体：芯片放入湿盒膜

8、为载体：芯片放入湿盒,37,37C 1hC 1h载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白五五 微阵列的封闭微阵列的封闭主要封闭试剂：主要封闭试剂：BSABSA101 1 化学性固定化学性固定化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属离子、混合离子等离子、混合离子等 2 2 生物性固定生物性固定生物性配基包括受体、配体、酶、抗体生物性配基包括受体、配体、酶、抗体- -抗原等抗原等 111 1 抗体抗体由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一种探针蛋白质

9、。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰度及确定新的蛋白质。度及确定新的蛋白质。2 2 寡聚核苷酸寡聚核苷酸适配体适配体, ,即寡聚核苷酸即寡聚核苷酸 能够作为捕获分子用于连接蛋白质，能够作为捕获分子用于连接蛋白质，并且有很高的特异性和亲和力。并且有很高的特异性和亲和力。 3 3 肽样寡聚体肽样寡聚体鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势，在蛋白质芯片系鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势，在蛋白质芯片系统中，多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。统中，多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。124 4 小分子配体小分子配体制备捕获分子最为有效的方式

10、制备捕获分子最为有效的方式小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行5 5 重组蛋白重组蛋白纯化或重组蛋白是另一种类型的捕获分子，特别是应用于在纯化或重组蛋白是另一种类型的捕获分子，特别是应用于在蛋白质功能分析方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋蛋白质功能分析方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋白质白质- -小分子间相互作用和自身抗体。重组蛋白可以以融合小分子间相互作用和自身抗体。重组蛋白可以以融合蛋白的形式，从体外表达的细菌系统中分离纯化。蛋白的形式，从体外表达的细菌系统中分离纯化。131 1 人工制备芯片人工制备芯片 主要有两种主要有两种, ,

11、即手工点样和免疫打点印迹装置。即手工点样和免疫打点印迹装置。 存在着的明显问题是不能够建立高密度芯片、样存在着的明显问题是不能够建立高密度芯片、样品和捕获分子消耗大和敏感性较低品和捕获分子消耗大和敏感性较低2 2 微阵列制备仪微阵列制备仪主要有主要有直接接触式和非接触式两种类型直接接触式和非接触式两种类型, ,也是目前市也是目前市场上常用的两种方法场上常用的两种方法141 1 酶标记酶标记常用的标记酶有辣根过氧化物酶常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP) (HRP) 、碱性磷酸、碱性磷酸酶酶(AP)(AP)等等. .2 2 荧光物标记荧光物标记荧光免疫分析中常用的荧光物质有异硫氨酸荧光素、荧光

12、免疫分析中常用的荧光物质有异硫氨酸荧光素、丹磺酰氯、罗丹明丹磺酰氯、罗丹明-异硫氰酯等。异硫氰酯等。151 1 以质谱技术为基础的直接检测法以质谱技术为基础的直接检测法如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDI-TOF- (SELDI-TOF-MS),MS),可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化, ,在电场力的作在电场力的作用下飞行用下飞行, ,通过检测离子的飞行时间计算出质量电荷比通过检测离子的飞行时间计算出质量电荷比, ,用以用以分析蛋白质的分子量和相对含量。分析蛋白质的分子量和相对含量。2 2 蛋白质标记

13、法蛋白质标记法常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中, ,通过采集通过采集各反应点的荧光位置、荧光强弱各反应点的荧光位置、荧光强弱, ,再经相关软件分析图像再经相关软件分析图像, ,即即可以获得有关生物信息。可以获得有关生物信息。161 1 用于蛋白质用于蛋白质- -蛋白质、蛋白质蛋白质、蛋白质- -核酸、核酸、蛋白质蛋白质- -脂类等相互作用研究；特异性脂类等相互作用研究；特异性蛋白质的筛选；功能蛋白质组研究。蛋白质的筛选；功能蛋白质组研究。 例如，应用酵母蛋白质芯片进行钙调蛋例如，应用酵母蛋白质芯片进行钙调蛋白的研究；应用磷脂酰肌醇来筛选磷白的

14、研究；应用磷脂酰肌醇来筛选磷脂酰肌醇的结合蛋白。脂酰肌醇的结合蛋白。172 2 疾病诊断的研究。疾病诊断的研究。目前，临床上应用的蛋白质芯目前，临床上应用的蛋白质芯片主要是用于检测肿瘤标志物的蛋白质芯片。它片主要是用于检测肿瘤标志物的蛋白质芯片。它的应用范围主要在以下几个方面：的应用范围主要在以下几个方面：（1 1）用于肿瘤患者的辅助诊断、疗效判断、病情监用于肿瘤患者的辅助诊断、疗效判断、病情监测、预后评估及判断肿瘤有无复发和转移等。测、预后评估及判断肿瘤有无复发和转移等。（2 2）用于肿瘤高危人群的定期筛查。高危人群主要用于肿瘤高危人群的定期筛查。高危人群主要是指是指4545岁以上的人群、患各种慢性炎症和各种慢岁以上的人群、患各种慢性炎症和各种慢性疾病的患者、有肿瘤家族史和肿瘤高发区居民性疾病的患者、有肿瘤家族史和肿瘤高发区居民等。等。（3 3）用于肿瘤分子流行病学调查及肿瘤生物学研究用于肿瘤分子流行病学调查及肿瘤生物学研究。183 抗体筛查抗体筛查。例如，例如，对噬菌体抗体库一对噬菌体抗体库一次可对次可对上万上万个不同的抗体克隆进行检个不同的抗体克隆进行检测。测。4 药物筛选、药代动力学研究。药物筛选、药代动力学研究。5 在毒理学中的应用。在毒理学中的应用。6 环境监测环境监测。7 食品卫生安全的监测。食品卫生安全的监测。1920