重组蛋白的表达系统(详细版)-ppt课件.ppt
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1、重组蛋白表达系统 1.原核表达系统 2.酵母表达系统 3.昆虫细胞表达系统 4.哺乳动物细胞表达系统 5.转基因植物表达系统 6.转基因动物表达系统 7.表达系统的选择1ppt课件一、 原核表达系统 原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高,对大部分蛋白来说都值得一试,尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。2ppt课件1.1 表达菌株表达菌株原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli,Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白;革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统
2、。常用大肠杆菌菌株有BL21(DE3)、BL21(DE3)Star、B834(DE3)等,这些菌株都敲除了蛋白酶,并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生噬菌体,带有噬菌体21抗性区和 lacI基因,lacUV5启动子,以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因,因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态,就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录,在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产,继而质粒上的目的DNA开始转录。同时,还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的重组蛋白,如甲硫氨酸营养缺陷型
3、表达硒代甲硫氨酸蛋白,溶解性增强的菌株表达毒性蛋白,补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等,表2给出了常用的大肠杆菌表达菌株。3ppt课件表2 常用E. coli表达菌株4ppt课件1.2 质粒载体质粒载体 大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体,质粒上的重要元件包括复制子,启动子,终止子,多克隆位点,信号肽,融合标签,筛选标记等(图1)。原核表达载体已经发展得比较完善,有多种质粒可供选择(表4)。 复制子: 复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下质粒拷贝数越高,重组蛋白的表达量就越高,但是高拷贝的质粒也会严重影响宿主的生长,质粒本身也不稳定,容易丢失和突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复
4、制的复制子,如pSC101;表达载体通常选用高拷贝的复制子,如pCoE1,pMBI(pUC),等。如果需要进行多个质粒的共转化,就要根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子,如pSC101和pUC共表达。5ppt课件 启动子: 表达重组蛋白时,我们需要考虑启动子的强弱、作用方式、调控方式和本底表达水平。表达载体通常选用强启动子以提高表达量,但弱启动子也有其优点,如降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。按照作用方式,启动子可以分为两类:组成型表达的启动子使宿主不停地表达重组蛋白,常用于工业生产,如S等;诱导型表达的启动子使宿主仅在受到诱导(诱导剂、温度等)时表达目的蛋白,诱导型启动子
5、使重组蛋白的表达容易控制,同时降低了外源蛋白对细菌生长的影响。6ppt课件图1:大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点7ppt课件8ppt课件早期大肠杆菌表达体系中,常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个弱启动子,很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表达的蛋白(如分子伴侣,蛋白抑制剂等)的载体,有很多都采用了经典的lac启动子。强启动子中,tac和trc是lac启动子的变体,其重组蛋白产率能够达到细胞总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉伯糖,本底表达量低,启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统中最高效的启动子,pE
6、T表达系统即是以它为中心构建的。T7启动子来源于噬菌体,专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合在宿主菌的基因组中。在噬菌体溶源的表达宿主菌,如BL21(DE3)中,lacI抑制T7 RNA聚合酶的表达,IPTG的加入可以解除这种抑制。当受到诱导时,T7 RNA聚合酶开始表达并结合在T7启动子上,启动重组蛋白的表达。T7 RNA聚合酶活性很高,转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍,使其下游的重组蛋白得到高效表达,其产率可以达到细菌总蛋白量的50%以上。T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一个lac操纵子,其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列。lac阻遏蛋白可以抑制宿主合
7、成T7 RNA聚合酶,并阻断T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录,从而降低重组蛋白的本底表达水平。PL、cspA启动子使宿主菌能够进行温度依赖型的表达。在温度敏感型突变体菌株中,PL等启动子使得宿主在30时抑制重组蛋白表达,而在42 时诱导重组蛋白表达;cspA启动子则被高温(37)抑制,低温(10)启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入,降低了使用成本,同时也降低了诱导剂对细胞的伤害。9ppt课件 终止子: 转录终止子按照是否依赖和不依赖因子的作用分为两类,这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解,显著延长mRNA的寿命,由此提高重组蛋
8、白的表达量。但是对于T7系统来说,由于T7 RNA聚合酶效率极高,宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译,因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子,只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。 启动子受细胞类型的限制,在不同的细胞系中有很大不同,因此需根据宿主细胞(尤其是真核宿主)的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。10ppt课件融合标签:融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽,方便重组蛋白的纯化、固定和检测,表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化,尽量不要引入融合标签,以免影响蛋白性质;如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱,如某些金属结合蛋白
9、可以结合Ni-NTA,某些糖结合蛋白能够特异识别糖类,也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程,并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒,如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选,应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签,它具有很多优点:标签较短(10-20个氨基酸残基),不带电(pH8.0),免疫原性差,通常不影响重组蛋白的结构和功能,Ni2+亲和力高,能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高,导致折叠困难、表达量低,可以选择较大的融合标签(GST、MBP、Trx等)帮助重组蛋白表达和折叠,提高重组蛋白溶解度,从而提高表达量。
10、较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止,纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化,所以在短标签能够达到目的的时候,尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要:N端标签(短的或长的)自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子,可以帮助目的蛋白表达,提高表达量,但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来,降低重组蛋白纯度,对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签;C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外,如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区,如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界
11、面、相互作用界面等,则要避免纯化标签位于该末端,以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响,但又是纯化所必须的,就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法:化学裂解,如溴化氰(CNBr)、羟胺(NH2OH)等,能够简单有效地去除标签,但反应条件苛刻(羟胺需要在pH9.0下反应),特异性较差,而且会引入不必要的修饰,除包含体蛋白的处理外已经很少使用了;酶解,如PPase等,其底物一般是一段比较长的肽链,特异性强,是目前比较常用的方法,缺点是酶切反应需要较长的时间,也增加了蛋白纯化的步骤,使纯化变得繁琐;IMPACT质粒,该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子
12、(intein),intein具有可诱导的自切割活性,使用IMPACT质粒表达的重组蛋白,只需要改变缓冲液的pH和温度,即可切掉融合标签。11ppt课件表3:常用融合标签12ppt课件筛选标记:在没有压力的环境下培养时,细菌中的外源质粒常常随着细胞复制而丢失。为了稳定质粒、表达重组蛋白,需要在载体中加入筛选标记,使宿主菌在原则压力下生长。原核系统中,常见的筛选标记有蓝白斑筛选(主要用于克隆)、营养缺陷性筛选和抗生素筛选,也可以将几种筛选手段混合起来使用。常见的抗生素筛选标记有:青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等。氨苄青霉素由于会被抗性细菌分泌的-内酰胺酶和酸性环境破坏掉,其筛选
13、效果会随时间降低,不适宜连续发酵,将抗性基因反转或换用对低pH不敏感的羧苄青霉素可以部分解决这个问题;卡那霉素不会被破坏,抗性较强,但是不同菌株的抗性差异较大,平板培养和悬浮培养液有所不同,使用时常需要针对个别菌株摸索适宜浓度;氯霉素抗性常见于有特殊用途的菌株和质粒,如pLysS。抗生素浓度的过高或过低都会降低重组蛋白的表达量,另外在使用多个载体进行共表达时,应注意不同的质粒要携带不同的筛选标记,抗生素浓度也要比单独表达适当降低。分泌表达:如果不希望重组蛋白表达在细胞质中,可以在重组蛋白的N端加入信号肽,引导蛋白穿越细胞膜。大肠杆菌的分泌表达一般是分泌到周质空间,各种芽孢杆菌则可以分泌到培养基
14、中,简化纯化流程。分泌表达的表达量通常远远低于胞质表达,但是也有其优势:跨膜过程可以帮助重组蛋白折叠,提高其溶解性和活性;周至空间和培养基的氧化环境能够帮助二硫键形成;也可用于除去牢固结合在蛋白上的配体;分泌到细胞外还能降低有毒重组蛋白对细胞的影响。13ppt课件表4:常用原核表达载体质粒14ppt课件1.3 优化表达条件优化表达条件重组蛋白的表达流程很少有一次成形的,为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量,表达条件和流程的优化是必须的。当重组蛋白不表达时:如果重组蛋白不表达(包含体和可溶蛋白都没有),首先检查cDNA和质粒是否正确,蛋白对宿主菌是否有很大毒性,然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。
15、原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见,通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白,即使在更换了宿主、载体后可以表达,表达量也不会很高,如果需要大规模生产,最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。当表达量不理想时:检查密码子构成,使其适应宿主菌的密码子偏好。稀有密码子,尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子,会降低mRNA稳定性,显著降低翻译速度,引起翻译提前中止、翻译移码和突变。将这些稀有密码子(尤其是N端!)突变为宿主偏好的密码子,能够显著提高表达水平,必要时可以根据宿主的偏好重新合成cDNA。另一个解决办法是与能够表达稀有tRNA的质粒共表达或直接采用带有该质粒的宿主菌,如BL21 c
16、odon plus、Rosetta等。更换菌株容易引起一系列问题,如启动子相溶性、额外的抗生素抗性等,使用时要多加注意。15ppt课件检查外源基因cDNA5端结构,高GC含量、回文结构和相距较近的两个起始密码子会阻碍转录起始,表达量不理想时应予以去除;检查终止密码,mRNA的通读会降低重组蛋白的质量和稳定性。不同终止密码子的终止效率在不同的物种中有很大差异,酵母和哺乳动物偏爱UAA和UGA,昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA;终止密码子3端紧邻的碱基也会影响终止效率,对于UAG来说,终止效率U、ACG,其他终止密码GU、AC;也可以多加一个终止密码子,以确保翻译在正确的位点结束。改变融合标签的位置,
17、N端的标签可以帮助翻译起始,从而提高蛋白的表达量。可溶表达低时:错误折叠是引起重组蛋白可溶表达量低,包含体表达量高的一个重要原因。改善重组蛋白折叠的方法有:降低诱导后培养温度。重组蛋白表达得越慢,其折叠效果就越好,大肠杆菌在4时依然可以表达重组蛋白,而将培养温度降低至25-30就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达;减少诱导剂。诱导剂浓度可以降低至1/10;选用Lac渗透酶缺陷型菌株,如Tuner、Rosetta等,也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时,减少诱导剂的效果更好;增加一个融合标签,或者更换一个分子量更大
18、的标签。一般来说,越大的融合标签在提高重组蛋白溶解度方面效果越好,如MBP、GST的效果要优于His6标签。以改善溶解度为目的的融合标签最好放置在目的蛋白的N端;改善二硫键的形成。大肠杆菌细胞内的还原环境会阻碍二硫键的形成,如果要表达有一对或多对二硫键、特别是需要二硫键来稳定分子内和分子间结构的重组蛋白,最好选用经过特别设计的载体和菌株,如pET39b(+)和pET40b质粒、BL21trxB, Origami和Rosetta-gami菌株。也可以考虑将蛋白分泌至周至空间,利用周至空间的氧化环境和酶来帮助二硫键的形成;只表达蛋白的可溶片段。16ppt课件可溶片段突变体与全蛋白之间经常有很大差异
19、,如等电点、抗原性、寡聚状态、活性、细胞定位等,突变时一定要谨慎考虑;突变掉可能引起顺反异构的Pro。顺反异构伴随着很高的能量跃迁,是蛋白折叠的能量壁垒。突变掉这样的Pro可以显著帮助重组蛋白折叠,但是同样会改变蛋白性质,要谨慎考虑;与分子伴侣和折叠酶共表达。微量的分子伴侣即可显著改善重组蛋白的折叠状况,与重组蛋白同源的分子伴侣效果更加明显。引入分子伴侣同样也会引起复制子相容性、额外的抗生素抗性等问题,常用的分子伴侣有ATP依赖的DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES,以及定位于周质空间的分子伴侣SurA、PpiD等。折叠酶可以帮助蛋白跨过折叠过程的能量壁垒,使重组蛋白更快更好的
20、折叠;在重组蛋白N端加入信号肽,将其引导至周质空间,用跨膜过程来帮助蛋白折叠和二硫键形成,并减轻蛋白降解;在培养基中加入重组蛋白的配体或底物类似物。配体结合,有时仅仅是配体的存在就能大幅度的改善蛋白的折叠和稳定性,此法不适用于无法被细菌摄取的配体;如果是多个蛋白共表达,可以考虑用一段柔软的linker将两个蛋白连接起来,使溶解度好的蛋白帮助溶解度差的蛋白折叠;改善蛋白稳定性。能够引起蛋白降解的因素很多,从蛋白自身性质到宿主性质不一而足,如果重组蛋白在表达时就被降解,表达量和稳定性就会受到很大影响。在大肠杆菌中表达重组蛋白,需要牢记N端法则:当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Ty
21、r和Trp时,重组蛋白半衰期只有2分钟,而小侧链的氨基酸残基,如Ala,则可以提高蛋白稳定性。因此在设计载体时,要特别注意第二个密码子,避免上述残基的出现。17ppt课件处理高毒性蛋白:外源基因的表达对大肠杆菌总有或多或少的影响,一般来说,经过改造的宿主可以在很大程度上容忍重组蛋白,重组蛋白可以占到细胞总蛋白量的50%或更高。但少数毒性极高的重组蛋白,其本底表达就会杀死原核宿主,质粒容易丢失,使其在大肠杆菌中很难得到高表达。以下方法可以降低重组蛋白的本底表达量。在培养基中加入1%的葡萄糖。葡萄糖是大肠杆菌的第一碳源,它的存在可以显著降低由其他碳源引起的本底表达。采用严格启动的载体和宿主。如PB
22、AD载体、pLacI宿主。采用低拷贝数的载体。降低表达载体质粒的拷贝数,可以明显降低基础表达水平。如pETcoco载体在每个细胞中仅一个拷贝,而受到IPTG诱导时又可以高效表达重组蛋白。采用可表达T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂,采用含有T7溶菌酶质粒的宿主,如pLysS,可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量,在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。除此之外,也可以通过共表达重组蛋白的抑制剂、提高抗生素浓度等方法提高毒性蛋白的表达量。18ppt课件1.4 包涵体表达:包涵体表达:在使用高效的E. coli表达系统时,过量表达的重组蛋白常会在细胞内凝聚,形成无活
23、性的包涵体沉淀。在早期实验中,包涵体被认为是重组蛋白表达的大敌:包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等,即使包涵体蛋白成功复性,其均一性和活性依然备受质疑。但是包涵体表达也有其优势:能够很轻松的获得超高的表达量,不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解,重组蛋白的毒性被大大抑制,杂蛋白含量低(10%),容易纯化等。由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展,表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受,成为重组蛋白表达的一个常用方案。与可溶蛋白相反,提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有利于包涵体的形成;在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键;在复
24、性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子可以帮助重组蛋白折叠;精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集;尝试多种物理手段,如透析、快速稀释和柱上复性等,有时对复性有奇效。包涵体的表达相对简单,但其复性过程仍是依赖经验的,没有通用的方法可以套用。19ppt课件2.酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点。酵母是一种单细胞低等真核生物,培养条件普通,生长繁殖速度迅速,能够耐受较高的流体静压,用于表达基因工程产品时,可以大规模生产,有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力,收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰,性质较
25、原核表达的蛋白质更加稳定,特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列,能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外,因此很容易纯化。应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处,如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等,造成表达蛋白质在结构上的不一致。另外,还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此,表达系统应根据具体情况作适当的改进。20ppt课件2.1 常用酵母表达系统常用酵母表达系统(宿主宿主-载体系统载体系统)3.1.1 酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统表达系统由于遗传和生理背
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