胚胎冷冻技术-ppt课件.ppt

1、ppt课件1胚胎冷冻技术ppt课件2发展历史发展历史 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代，当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获得成功。 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小鼠胚胎的成功保存。 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷冻小鼠胚胎获得成功。ppt课件3 1985年Rau和Fahy用高浓度的DMSO、乙酰胺、丙二醇和聚乙二醇分别组成玻璃化溶液，对8细胞期的小鼠胚胎进行了一步冷冻实验，获得87.5%的冻后发育率。此后。牛、绵羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后应用玻璃化冷冻法获得成功。目前该技术已广泛应用于畜牧生

2、产。ppt课件4原理原理 将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第5-6天的囊胚）两种降温方式使胚胎能静止下来并可在-196度的液氮中保存的一种方法。ppt课件5医疗应用医疗应用 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内，将增加受孕的机会。 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保存。 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。ppt课件6优势优势 可以合理限制移植胚胎数，降低多胎妊娠率。 为胚胎移植失败

3、或流产患者提供再次移植机会,不必反复进行女性超促排卵。 在超排卵周期出现卵巢过度刺激综合征迹象时，取消胚胎移植，将胚胎进行冷冻保存，在其后非刺激周期进行冷冻胚胎移植。ppt课件7方法方法1、常规缓慢冷冻、常规缓慢冷冻 此方法需专用的冷冻仪,可获得较高的移植妊娠率,是目前生产中广泛采用广泛采用并且最为成功最为成功的冷冻方法。冷冻液一般为1.4mol/L甘油+PBSS(含20%NCS的PBS)。ppt课件82、一步冷冻法、一步冷冻法 利用高浓度的抗冻剂使胚胎在冷冻前脱水,从而减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成。其特点是胚胎在室温脱水后胚胎在室温脱水后不需要特殊的降温程序不需要特殊的降温程序,能在很短得

4、时间内完成冷冻过程,具有重要的实用价值。ppt课件93、玻璃化法、玻璃化法(vitrification) Rall和Fahy(1985)提出了玻璃化冷冻胚胎的方法,即可用几种保护剂混合组成一种玻璃化(vitrificationsolution,VS),它在低温时变的很粘稠,不发生结晶就可固化,形成不规则结构的玻璃样固体,能保持液态时正常的分子和离子分布,因而用玻璃化液进行胚胎冷冻前处理有较好的保护效果。ppt课件10 胞质部分脱水后的玻璃化和胞外溶液的部分玻璃化是有效冷冻保存胚胎的重要因素。胚胎在这种玻璃样固体中脱水到一定程度,可引起内源性胞质大分子(如蛋白质) 及已渗入白细胞内的冷冻保护剂浓

5、缩,从而使细胞在降温过程中得到保护。ppt课件11 玻璃化冷冻具有许多冷存液没有的优点操作简单、快捷、价格便宜、不需要操作简单、快捷、价格便宜、不需要特殊设备特殊设备,避免细胞内外冰晶形成,更重要的是其粘滞性高,在6冷存后形成的玻璃样结构,保持了分子、离子正常的扩散与分配,细胞内物冰晶形成,维持了正常的细胞超微结构,减少了对透明带和基因的损害,提高了冷冻存活率和妊娠率。ppt课件12 应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、25%PROH或25%乙二醇。 玻璃化冷冻技术正处于实验

6、研究到临床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一种选择。临床应用临床应用ppt课件13 超速玻璃化冷冻超速玻璃化冷冻 是指使用微型工具,如Cryoloop、CPS、Cryotop和电镜铜珊(EMG)等,通过极度缩小含胚胎玻璃化溶液的体积来实现“即时玻璃化”,使降温速率由普通玻璃化的2000/min提高到20000/min以上,有效避免了细胞内冰晶形成,并减轻了寒冷损伤,提高了冷冻效率。ppt课件14与传统玻璃化冷冻方法比较与传统玻璃化冷冻方法比较 超速玻璃化冷冻一方面提高了降温速率提高了降温速率,另一方而缩短了胚胎与冷冻保护剂溶液的接缩短了胚胎与冷冻保护剂溶

7、液的接触时间触时间,进一步提高了冷冻效率提高了冷冻效率。 在辅助生殖技术领域,Cryoloop超速玻璃化冷冻人囊胚获得了较高的妊娠分娩率,结果比开放型拉细麦答(OPS)、普通麦管玻璃和CPS能更好的保存胚胎的形态和活力。ppt课件15 到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚胎,在国内外均获得成功。 2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。 北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻”技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采

8、用了与世界首例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。人类胚胎冷冻的应用现状人类胚胎冷冻的应用现状ppt课件16 从冷冻技术第一次成功应用于人类胚胎并获妊娠至今,有关技术、方法不断成熟。据报道,正常胚胎移植的妊娠失败率可达到40%60%,冷冻胚胎尤其是冷冻IVF人胚胎成功率就更低,一些研究结果认为,816细胞的人胚胎冷冻效果较好,也有认为,4细胞期胚胎冷冻后的成活率也不低。ppt课件17 从总体上讲,冻胚移植的妊娠率比鲜胚低,影响人类胚胎冷冻保存结果的因素是多方面的,主要有胚胎的质量(大小、渗透性等)和分裂(发育)阶段、母体年龄及移植时机以及冷冻保护剂(渗透性、毒性等)和冷冻溶解程序等几方面。p

9、pt课件18 另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否发生老化的问题还缺乏直接的实践证据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育潜力无法判断。ppt课件19 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷冻、快速溶解方法,但是其他方法也有其自身优点。因此,在实验中应综合考虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选择恰当的方法。ppt课件20 玻璃化冷冻方法简单、快速,防止了冰晶对胚胎造成的损伤,但由于玻璃化溶液的浓度极高且溶质存在毒性,会使胚胎的成活率降低,所以当今研究热点集中在如何减少高浓度溶液对胚胎的毒害作用。 主要有以下几个方面：主要有以下几个方面： 通

10、过两步平衡胚胎;缩短平衡时间;降低平衡温度;使用蔗糖、海藻糖等抗毒性物质。ppt课件21 目前使用的冷冻保护剂对胚胎尚有一定的毒性,选择恰当的冷冻保护剂也十分重要,人胚胎的保护剂为DMSO和丙二醇,蔗糖等非渗透性保护剂和渗透性保护剂联合使用常取的较好的效果。ppt课件221、胚胎冷冻技术如今已趋向简单化、实用化及产业化,特别是牛的胚胎冷冻技术已经日臻成熟。但是,对人类胚胎的冷冻技术有待于进一步提高,尤其是冷冻过程中细胞形态和代谢上的影响是制定冷冻保存的最大难题。展望展望ppt课件232、胚胎冷冻技术为建立优良品种的胚胎库或基因库提供了条件,同时也便于胚胎的运输和移植。胚胎冷冻保存的自身优越性决定其有很大的发展潜力,尽管其基础研究等还比较欠缺。所以,人们必须对人类胚胎冷冻技术的方法,程序以及冷冻液的选择等做进一步的研究。ppt课件243、随着现代分子生物学的发展,人们对于发育生物学和低温生物学的研究将会更加深入,动物胚胎冷冻技术将会进一步完善,不久将来,人类胚胎冷冻保存及解冻存活率,都可望取得突破性进展。ppt课件25thank you ！