流式细胞技术课件.ppt
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- 细胞 技术 课件
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1、第第15章章 流式细胞技术的原理和应用流式细胞技术的原理和应用陈鲤翔 副教授Email:流式细胞技术(流式细胞技术(Flow cytometry, FCM) 是以流式是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其他生物微粒(如细菌)的理化特性进行多参数定他生物微粒(如细菌)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。量分析和分选的技术。流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部起来的对
2、细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。速测量并可分类收集的高技术。30年代:设想使细胞检测自动化年代:设想使细胞检测自动化50- 60年代:分层鞘流原理、分光光度计定量细胞年代:分层鞘流原理、分光光度计定量细胞成分及结合测量值对细胞分类,提出细胞分选成分及结合测量值对细胞分类,提出细胞分选70年代:单克隆抗体技术和荧光标记技术年代:单克隆抗体技术和荧光标记技术1973年:第一台商用流式细胞仪年:第一台商用流式细胞仪FACS I发展方向:荧光染料的开发、细胞的制备方法、提发展方向:荧光染料的开发、细
3、胞的制备方法、提高电子信号的处理能力等高电子信号的处理能力等流式细胞仪的发展史流式细胞仪的发展史BD公司流式细胞仪公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAriaMoFlo Astrios EQ 超高速流式分选系统超高速流式分选系统Gallios流式细胞仪流式细胞仪Beckman公司公司流式细胞仪流式细胞仪Navios流式细胞分析系统流式细胞分析系统 测量测量速度快,最快可在速度快,最快可在1 1秒钟内计测数万个细胞;秒钟内计测数万个细胞; 可可进行多参数测量,可以对同一个细胞做有关物理(如大小、内进行多参数测量,可以对同
4、一个细胞做有关物理(如大小、内部结构)、化学特性(如部结构)、化学特性(如DNADNA、RNARNA)的多参数测量,并具有明)的多参数测量,并具有明显的统计学意义;显的统计学意义; 是是一门综合性的高科技方法,它综合了一门综合性的高科技方法,它综合了激光技术激光技术、计算机技术计算机技术、显微荧光光度技术显微荧光光度技术、分子生物学技术分子生物学技术、免疫学技术免疫学技术、流体力学流体力学、细胞化学细胞化学、图像技术图像技术等众多等众多领域的知识和成果;领域的知识和成果; 既是既是细胞分析技术,又是精确的分选技术细胞分析技术,又是精确的分选技术。细胞不被破坏,测量快速、大量、准确、灵敏、定量流
5、式细胞术的特点流式细胞术的特点应用应用:细胞生物学,肿瘤学,血液学,免疫学,药:细胞生物学,肿瘤学,血液学,免疫学,药理学,遗传学及临床检验学等理学,遗传学及临床检验学等细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核核- -特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子, PH, PH值值, , 膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性 液流液流系统系统 光学光学系统系统 数据处理系统数据处理系统一、流式细胞技
6、术原理一、流式细胞技术原理1、流式细胞仪的基本结构:、流式细胞仪的基本结构: 由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成 待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染荧光染料标记的单抗对其染色色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流从样品管进入流动室形成样本流 鞘液:辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样鞘液:辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围,保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置,防止其本流的周围,保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置,防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。靠近孔壁而阻塞喷孔。(1)液流系统)液流系统Fluorescence
7、SignalFocused Laser BeamShealth Fluid液流系统示意图液流系统示意图Injector Tip样本管鞘液管 激光光源:气冷式氩离子激光器激光光源:气冷式氩离子激光器 分色反光镜:反射长分色反光镜:反射长/ /短波长,通过短短波长,通过短/ /长波长长波长 光束成形器:两十字交叉放置的透镜光束成形器:两十字交叉放置的透镜 透镜组:形成平行光,除去室内光透镜组:形成平行光,除去室内光 滤片:长通、短通、带通滤片:长通、短通、带通 光电倍增管:光电倍增管:FS, SSFS, SS(散射光),(散射光),FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3,
8、FL4(荧光)(荧光)(2)光学系统)光学系统光学系统示意图光学系统示意图 散射光的测定散射光的测定细胞在液柱中与激光束相交时向周围细胞在液柱中与激光束相交时向周围360360立体角方向立体角方向散射的光线信号,它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗散射的光线信号,它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关,主要分为粒折射等有关,主要分为前向散射光前向散射光和侧向散射光侧向散射光。光信号的测定光信号的测定前向散射光(forward scatter, FS):激光束照射细胞时,光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比。侧向散射光(
9、side scatter, SS):激光束照射细胞时,光以90角散射的讯号,用于检测细胞内部结构属性。 测得的FS与SS信号通过计算机处理,可得到FS-SS图,由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理,但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途:从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光信号区分开,送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同
10、特征。线性放大器和对数放大器l荧光测定荧光测定l荧光补偿荧光补偿FITCAPCPEPerCP/Cy5.5每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光,然而这些荧光的发射光谱会发生重叠,有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正荧光渗漏的过程,如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。荧光荧光补偿补偿PEFITCPE+ cellsFITC + cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signalFor Pure PE+ cells,= FITC signal - % PE signalAf
11、ter compensationPEFITCPE+ cellsFITC + cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cellsX-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cellsPEFITCPE+ cellsFITC + cellsOVER compensation细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电l细胞分选 分选速度:单位时间内分选的细胞数量。与悬液分选速度:单位时间内分选的细胞数量
12、。与悬液中细胞的含量成正比。中细胞的含量成正比。 分选纯度:分选出的目的细胞占所有收获细胞的分选纯度:分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。百分率。 分选收获率:实际收获的分选细胞与设定通过测分选收获率:实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率:从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞分选得率:从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量,再经分选后得到目的细胞的实际得率。的总量,再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。与分选速度成反比。分选的技术要求分选的技术要求(3)数据处理系统)数据处理系统FS:反映颗粒的大
13、小:反映颗粒的大小SS:反映颗粒的内部结构复杂程度:反映颗粒的内部结构复杂程度FL:反映颗粒被染上的荧光数量多少:反映颗粒被染上的荧光数量多少参数参数 单参数直方图单参数直方图 双参数点图、二维等高图双参数点图、二维等高图 三参数直方图三参数直方图 多参数分析多参数分析数据显示方式数据显示方式 由一维参数由一维参数(散射散射光或荧光光或荧光)与颗粒与颗粒计数计数(COUNT)构构成,反映同样散成,反映同样散射光或荧光强度射光或荧光强度的颗粒数量的多的颗粒数量的多少。少。单参数直方图单参数直方图双参数点图双参数点图 双参数直方图:纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数,根据这两个参数就可以确
14、定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号,最常用的是点密图,在图中,每个点代表一个细胞,点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 用等高线来表示细胞数,在一条等高线上细胞数相同,不同的等高线上细胞数不同。二维等高图二维等高图三参数直方图三参数直方图 三维坐标匀为参数(散射光或荧光)而非细胞数。 多参数分析:当细胞标记了多色荧光,被激发光激发后,得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。 一般利用所得参数的两两组合并利用设门(Gate)技术,来分析参数之间的相互关系。多参数分析多参数分析 Gate设置:指在某一张选定参数的直方图上,根据该图的细胞群分布选定其
15、中想要分析的特定细胞群,并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。 门(门(Gate)设置)设置A 淋巴细胞B 单核细胞C 中性粒细胞A、B、C均为任意门区阈(区阈(region, Rregion, R)与门)与门(gate, G ) (gate, G ) 是两个相关的概念,区是两个相关的概念,区阈可与门对应,但是也可以包含于门。阈可与门对应,但是也可以包含于门。Region设置设置D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字门分析时,就可
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