实时荧光定量PCR技术的原理及应用-ppt课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《实时荧光定量PCR技术的原理及应用-ppt课件.ppt》由用户(三亚风情)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 实时 荧光 定量 PCR 技术 原理 应用 ppt 课件
- 资源描述:
-
1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)1ppt课件讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用2ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRP
2、CR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团,利用荧光,利用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程,最后通过标进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法准曲线对未知模板进行定量分析的方法 3ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 实时原理实时原理 常常 规规 PCRPCR技术:技术: 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测实时定量实时定量PCRPCR技术:技术: 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信
3、号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每每一个循环扩增产物量的变化一个循环扩增产物量的变化,通过,通过CtCt值值和标准曲线和标准曲线的分析对的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析4ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 定量原理定量原理介绍三个概念:介绍三个概念: 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量?如何对起始模板定量?通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析5ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 扩增曲线扩增曲线扩增曲线图:扩增曲线图: 横坐标:扩增
4、循环数(Cycle);纵坐标:荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件6ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光阈值荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 (threshold threshold ):q 前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline),即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置:原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值7ppt课件实时荧
5、光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义: PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value 8ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴:横轴:PCR反映循环数反映循环数纵轴:荧光信号量纵轴:荧光信号量CtCt值的特点值的特点:相同模板进行96次扩增,终点处产物量不恒定; Ct值则极具重现性9ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反应: X=X0*2n非理想的PCR反应: X=X0 (1+Ex)n n:扩增反应的循环次
6、数 X:第n次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率10ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log Log浓度与循环数呈线性关系,根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系,根据样品扩增达到域值的域值的循环数
7、即循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量就可计算出样品中所含的模板量11ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多,荧光达到域值的循环数越少,即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量12ppt课件Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量2513ppt课件讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验
8、设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用14ppt课件非特异性荧光标记:非特异性荧光标记: 1、 SYBR Green 特异性荧光标记:特异性荧光标记: 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - DNA - DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记QQR15ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1 -1 -SYBR G
9、reen 法SYBR Green 16ppt课件SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时,DNA双链分开,无荧光q 复性和延伸时,形成双链DNA, SYBR Green 发荧光,在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 17ppt课件5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation18ppt课件温度温度荧光强度荧光强度Tm19ppt课件-dIdTTm2
10、0ppt课件SYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析,单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析,出现杂峰其他产物出现非特异性荧光,因此定量不准确非特异性产物非特异性产物21ppt课件Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多,荧光达到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性关系,根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量22ppt课件SYBR Green 法 -PCR反应的建
11、立反应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测2.Primer:引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同23ppt课件天为时代公司利用SYBR Green 法定量检测样品DNA24ppt课件SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 融解曲线分析:可以优化PCR反应的条件,对常规PCR有指导意义,如对primer的评价
12、;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。25ppt课件SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点26ppt课件与目标序列互补实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2 -TaqMan2 -TaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter, R) ,如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团 (Que
13、ncher, Q)v 探针完整,R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ,无荧光, R与Q分开,发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性,可水解探针27ppt课件TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光28ppt课件TaqManTaqMan 法法 PCRPCR反应的建立反应的建立1、引物、探针的设计: 探针Tm为68-70 ,30 bp, 5不能有G,G可能会淬灭荧光素, 引物尽量靠近探针,扩增片段400 bp,引物Tm为59-60 2、反应参数的确定: 一般为:94 ,10-20S 60,30-60S(Taq酶53外切核酸酶
14、活性在60 最高) 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ,45 S,3、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,最大信号/背景比值 引物浓度:50-900nM 探针浓度:50-250nM4、其他与常规PCR相同29ppt课件已肝病人血液中HBV的绝对定量q目的:利用核酸检测,缩短检验时间,提高灵敏度,为诊断用药提供依据q方法:从血液中提取病毒DNA,扩增病毒基因,以TaqMan探针进行检测q设置对照:浓度为106、105 、104 103 的标准样品各一个,设阴性和空白对照q实验步骤:提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序q结果:获取血液样品中HBV DNA的精
15、确copy数利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBV30ppt课件数据分析分析结果: HBV DNA的精确copy数为3.7X105利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBV31ppt课件TaqManTaqMan法法 应用范围应用范围q 起始模板的定量q 基因型分析q 目的基因定量q 产物鉴定q SNP分析32ppt课件TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记,价格较高q 不易找到本底低
16、的探针缺 点33ppt课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3- Molecular beacon 3- Molecular beacon 法法( (分子信标分子信标) )标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针34ppt课件Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 工作原理工作原理q 荧光共振能量转移(FRET)q 探针与DNA杂交时产生荧光 -变性过程:产生非特异性荧光 -延伸过程:不产生荧光 -退火过程:产生特异性荧光,检测荧光信号35ppt课件Molecu
展开阅读全文