HIV检测技术-ppt课件.ppt

1、HIV抗体检测技术抗体检测技术艾滋病诊断的特殊性艾滋病诊断的特殊性 n高度依赖实验室诊断高度依赖实验室诊断nHIV检测的严肃性：检测的严肃性： 保证输血、器官移植的安全保证输血、器官移植的安全 错误结果将导致严重的法律问题错误结果将导致严重的法律问题n结果严格保密结果严格保密艾滋病病毒的形态艾滋病病毒的形态v HIVHIV的逆转录酶缺乏的逆转录酶缺乏3 35 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 ，无，无法修复逆转录和复制过程中发生的错误法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。艾滋病病毒的结构艾滋病病毒的结构HIV生活周期生活周期吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放 H

2、IV-1HIV-1通过通过gp120gp120与靶细胞表面与靶细胞表面CD4CD4分子和趋化因子受体结合分子和趋化因子受体结合HIV感染后的血清学改变感染后的血清学改变n诊断：确定个体诊断：确定个体HIVHIV感染状况而进行的检测，包括临床检感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。检等。n监测：了解不同人群监测：了解不同人群HIVHIV感染率及其变化趋势而进行的检感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。n血液筛查：防止输血传播血液

3、筛查：防止输血传播HIVHIV而进行的检测，包括献血员而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。筛查和原料血浆筛查。HIVHIV抗体检测目的抗体检测目的n筛查试验筛查试验n初筛初筛n复检复检n确证试验确证试验HIVHIV抗体检测程序抗体检测程序筛查试验筛查试验筛查试剂筛查试剂n必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。性高的试剂。HIVHIV抗体筛查样品抗体筛查样品n血清、血浆、血清、

4、血浆、滤纸干血斑滤纸干血斑、唾液和尿液。、唾液和尿液。筛查方法筛查方法n酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）n化学发光或免疫荧光试验（化学发光或免疫荧光试验（CLIACLIA）：采用发光：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。n快速检测（快速检测（RTRT）及其它检测试验）及其它检测试验 (1)(1)明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验(PA)(PA) (2) (2)斑点斑点EIAEIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 (3)(3)免疫层析试验免疫层析试验HIVHIV抗体筛查试验抗体筛查试验初筛

5、试验初筛试验n对呈阴性反应的样品，可出具对呈阴性反应的样品，可出具HIVHIV抗体阴性（抗体阴性（- -）报告）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。证试验。复检试验复检试验n对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。或不同厂家的试剂进行复检试验。n如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试

6、剂。括一种抗原抗体联合试剂。n艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。确证实验室可以直接进行确证试验。(1)(1)酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）n可使用血液、唾液、尿液样品可使用血液、唾液、尿液样品n单纯单纯HIV抗体检测试剂抗体检测试剂nHIV抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中HIV-1P24抗原和抗原和HIV-1/2抗体。抗体。nHIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的的HIV抗原或

7、抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidphasespecificdetection ofconjugate第一代第一代病毒裂解液病毒裂解液HIV-1IgG 抗体抗体HIV-1 -IgG抗体抗体第二代第二代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 IgG抗体抗体第三代第三代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -OIgM / IgG 抗

8、体抗体HIV-1 / -2 / -O病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -O第四代第四代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 AbIgM / IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 / -Op24 抗原抗原病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 抗体抗体method间接间接间接间接夹心夹心夹心夹心 固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶标二抗酶标二抗底物底物EEE间接法检测抗体间接法检测抗体E固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶

9、标抗原酶标抗原底物底物EE双抗原夹心法检测抗体双抗原夹心法检测抗体ELISA测定中的干扰因素测定中的干扰因素n内源性干扰因素内源性干扰因素n外源性干扰因素内源性干扰因素内源性干扰因素 n类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子等物小分子等外源性干扰因素n溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融凝固不全、反复冻融操作中的注意事项操作中的注意事项n加样加样n温育温育n洗板洗板n显色显色标准化操作及流程标准化操作及流程 试剂准备、标本收集、测定方法和仪

10、器操试剂准备、标本收集、测定方法和仪器操作写出正确的作写出正确的“标准操作程序标准操作程序”(SOP)，所有所有的实验技术人员在进行相关测定时，必须严格的实验技术人员在进行相关测定时，必须严格按相应的按相应的SOPSOP进行操作。进行操作。 ELISAELISA法结果判断法结果判断n临界值概念临界值概念: : 将检测的阳性和（或）阴性对照的将检测的阳性和（或）阴性对照的ODOD值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值果的界值n判断标准判断标准: :标本标本ODOD值与临界值的比值大于等于值与临界值的比值大于等于1(S/CO1)1(S/CO1)为阳

11、性（对间接法及双抗原夹心法）为阳性（对间接法及双抗原夹心法）n注意注意: :不同厂家、不同方法临界值计算公式不同不同厂家、不同方法临界值计算公式不同ncutoff=NC+0.1(0.15,0.12) cutoff=NCcutoff=NC+0.1(0.15,0.12) cutoff=NC* *2.12.1酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）n优点：准确性高、价格低廉、判断结果优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存标准客观、结果便于记录和保存n用途：流行病学监测及临床大量标本的用途：流行病学监测及临床大量标本的检测检测(2)化学发光或免疫荧光试验化学发

12、光或免疫荧光试验n采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。联合检测抗原抗体。nHIVHIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的样品和酶或荧光标记的HIVHIV抗原或抗体，加抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。规定。 （3 3）快速检测（）快速检测（RTRT）及其它检测试验）及其它检测试验优点优点: :试验简便快速，适用于应急检测、门诊急试验简便快速，适

13、用于应急检测、门诊急诊检测。诊检测。不需专门设备和人员培训不需专门设备和人员培训, ,一般可在一般可在10103030分钟内得出结果。分钟内得出结果。缺点缺点: :肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。存。（1 1）明胶颗粒凝集试验（）明胶颗粒凝集试验（PAPA）n将将HIVHIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIVHIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原原- -抗体反应，根据

14、明胶颗粒在孔中的凝集情况判抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。读结果。快速诊断试剂快速诊断试剂PAPA法原理法原理（2 2）斑点）斑点EIAEIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）和斑点免疫胶体金（或胶体硒）n以硝酸纤维膜为载体，以硝酸纤维膜为载体，HIVHIV抗原点状固定在膜上抗原点状固定在膜上, ,加血清样品。加血清样品。n斑点斑点EIAEIA法用酶标记抗体，以后步骤同法用酶标记抗体，以后步骤同ELISAELISA。n斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的胶体金斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的胶体金（或胶体硒）（或胶体硒）A A蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。蛋白标记，用渗滤法作为洗涤

15、方法。n阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在时间在10 min10 min以内，使用抗原量少。以内，使用抗原量少。快速诊断试剂快速诊断试剂金标诊断试验原理金标诊断试验原理快速诊断试验快速诊断试验（3）免疫层析试验免疫层析试验( (金标法、硒标法金标法、硒标法) )n以硝酸纤维膜为载体。n加样区：预包被胶体金-抗原/胶体金-protein A结合物n测试区（T）：固定有重组HIV抗原，n质控区：抗HIV单克隆抗体/抗-protein A抗体快速诊断试剂快速诊断试剂全血样品 加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取

16、结果硒标法操作步骤硒标法操作步骤病人条质控条快速诊断试验快速诊断试验优点优点: :试验简便快速，适用于应急检测、门诊急试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。诊检测。不需专门设备和人员培训不需专门设备和人员培训, ,一般可在一般可在10103030分钟内得出结果。分钟内得出结果。缺点缺点: :肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。存。n注意：一定要将试剂平衡至室温注意：一定要将试剂平衡至室温快速诊断试剂快速诊断试剂HIV抗体确认试验抗体确认试验n确认试验的试剂：确认试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。n确认试验方法：

17、确认试验方法：n免疫印迹试验(WB)n条带免疫试验(LIATEK HIV)n放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA) 国内常用的确认试验方法是WB。a 强阳性对照（强阳性对照（HIV-1和和HIV-2）b弱阳性对照（弱阳性对照（HIV-1）c阴性对照阴性对照d典型的典型的HIV-2血清阳性反应血清阳性反应WB确认HIV感染的判定标准和判定结果的基本原则 nHIV-1抗体阳性：gp41和Gp120/gp160或加上gp41加上P24n阴性：无HIV抗体特异带出现。n可疑：出现HIV抗体特异条带，但不足以判定阳性 HIV抗体确认试验不确定结果抗体确认试验不确定结果nP24 ：非特异性反

18、应（孕妇，正常人）：非特异性反应（孕妇，正常人）nGp160：非特异性反应，感染早期，感染晚期：非特异性反应，感染早期，感染晚期nGp160，gp120：非特异性反应，感染早期，感染晚期：非特异性反应，感染早期，感染晚期nGp160，p24：非特异性反应，感染早期，感染晚期：非特异性反应，感染早期，感染晚期HIV抗体确认试验不确定结果抗体确认试验不确定结果nP24 ：非特异性反应（孕妇，正常人）：非特异性反应（孕妇，正常人）nGp160：非特异性反应，感染早期，感染晚期：非特异性反应，感染早期，感染晚期nGp160，gp120：非特异性反应，感染早期，感染晚期：非特异性反应，感染早期，感染晚期

19、nGp160，p24：非特异性反应，感染早期，感染晚期：非特异性反应，感染早期，感染晚期nGp160，gp120，p24：感染早期，感染晚期：感染早期，感染晚期 污染？污染？筛查试验阳性反应样品筛查试验阳性反应样品HIV抗体抗体确证检测流程图确证检测流程图结合流行病学资料，可以在结合流行病学资料，可以在4 4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到展，但不满足阳性标准，应继续随访到8 8

20、周。如带型没有进展或呈阴性反应周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足则报告阴性；满足HIVHIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。可视情况决定是否继续随访。确证试剂确证试剂根据具体情况进一步根据具体情况进一步检测检测HIV-2HIV-2报告阴性报告阴性出现出现HIV-2HIV-2指示条带指示条带阴性反应阴性反应不确定反应不确定反应报告报告HIV-1 阳性阳性HIV-1 阳性反应阳性反应HIVHIV抗体检测的要点抗体检测的要点1 1、根据目的选择检测方法及检测策略。、根据目的选择检测方法及检测策略。2 2

21、、严格遵守实验室、严格遵守实验室SOPSOP。3 3、筛查试验阳性，须作确证实验。、筛查试验阳性，须作确证实验。4 4、筛查试验阴性，不应做确证实验。、筛查试验阴性，不应做确证实验。5 5、筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。、筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。HIV 抗体检测不能用来诊断抗体检测不能用来诊断 ：nHIV 急性感染急性感染n新生儿新生儿HIV 感染感染艾滋病病毒感染产妇所生儿童艾滋病病毒感染产妇所生儿童阳性阳性阴性阴性用另一种不同原理或不同厂家用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测生产的筛查试剂再次检测1212个月进行个月进行HIVHIV抗体筛查试验抗体筛查试验确证

22、试验确证试验1818个月时再进行个月时再进行HIVHIV抗体筛查试验抗体筛查试验报告报告HIVHIV抗体检测结果阴性抗体检测结果阴性艾滋病感染产妇所生儿童艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程抗体检测流程阳性阳性阴性阴性阴性阴性阳性阳性用另一种不同原理或不同厂用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测家生产的筛查试剂再次检测阴性阴性阴性阴性阳性阳性报告报告HIVHIV抗体检测结果阳性抗体检测结果阳性提供咨询，继续提供咨询，继续随访，随访，4 4周后再次周后再次进行确证试验进行确证试验不确定不确定阳性阳性婴幼儿HIV感染的抗体检测n适用范围：适用范围：nHIVHIV感染产妇所生婴幼儿；已满感染产妇所生婴幼儿；已满1818个月的婴幼儿，其个月的婴幼儿，其母亲母亲HIVHIV感染状态不详，儿童出现感染状态不详，儿童出现HIVHIV相关临床表现，相关临床表现，临床怀疑临床怀疑HIVHIV感染的儿童。感染的儿童。 n婴儿应于婴儿应于1212个月进行个月进行HIVHIV抗体检测，结果阴性则排除抗体检测，结果阴性则排除感染，纳入正常儿童保健；阳性者继续追踪随访，至感染，纳入正常儿童保健；阳性者继续追踪随访，至1818个月再次进行个月再次进行HIVHIV抗体检测，结果阴性排除感染。抗体检测，结果阴性排除感染。谢谢！谢谢！