临床微生物学检验：细菌耐药性检测课件.ppt

1、2022-4-261细菌耐药性检测2022-4-262通过学习希望能回答以下问题1.beta内酰胺类抗菌药物有哪些？其抗菌机理是什么？2.氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和氯霉素类抗菌机理3.抗菌药物敏感试验中B组药物在何种情况下可以选用？4.纸片扩散法（K-B)药敏实验的原理和影响因素？5.药敏实验结果为S、I、R的意义是什么？6.何为MIC?何为E实验？7. 联合药敏实验结果为拮抗作用、无关作用、累加作用和协同作用的意义分别是什么？8.细菌耐药的常见机制有哪些？何为ESBLs、AmpC酶、碳青霉烯酶、MRS?9.Beta-内酰胺酶检测的常用试验是什么？如何判断结果？2022-4-263思考

2、题10.检测ESBL、MRSA的意义何在？11.葡萄球菌在何种情况下需要做D试验？为什么？12.K-B法药敏试验所用的培养基是什么？接种的菌液浓度一般为多少？培养基的厚度、pH一般为多少？13.肉汤稀释法药敏试验所用的培养基是什么？接种细菌的终浓度一般为多少？肠杆菌科细菌药敏检测的质控菌株是什么？14. 琼脂稀释法所用的的培养基是什么？接种的菌液浓度一般为多少？培养基的厚度、pH一般为多少？2022-4-264思考题15.15.何为何为MICMIC5050和和MICMIC9090？16.16.如何判定肠球菌是氨基糖苷类高水平耐药？如何判定肠球菌是氨基糖苷类高水平耐药？2022-4-265抗菌药

3、物发现史抗菌药物发现史上几个重要的里程碑上几个重要的里程碑 19291929年，英国细菌学家年，英国细菌学家FlemingFleming发现发现微生物微生物的拮抗作用的拮抗作用，2020世纪医学界最伟大的创举。世纪医学界最伟大的创举。 19321932年，德国药物学家年，德国药物学家DomagkDomagk发现百浪多发现百浪多息息-第一个合成的第一个合成的磺胺类磺胺类药物，使现代药物，使现代医学进入化疗新时代。医学进入化疗新时代。2022-4-266抗菌药物时代的开创抗菌药物时代的开创青霉素的发现青霉素的发现2022-4-267抗菌药物发现史抗菌药物发现史上几个重要的里程碑上几个重要的里程碑

4、19401940年，年，ChainChain和和FloreyFlorey接受美国政府的邀接受美国政府的邀请，进行青霉素的研究开发，发明可供请，进行青霉素的研究开发，发明可供人人体注射用的青霉素体注射用的青霉素，开创了化疗新时代。，开创了化疗新时代。 19421942年，美国科学家年，美国科学家WaksmanWaksman发现发现链霉素链霉素，奠定了从微生物代谢产物中寻找抗菌药物奠定了从微生物代谢产物中寻找抗菌药物的基础，造就了抗菌药物发展的黄金时代。的基础，造就了抗菌药物发展的黄金时代。2022-4-268抗菌药物发现史抗菌药物发现史上几个重要的里程碑上几个重要的里程碑 19591959年，年

5、，BatchelorBatchelor和和19611961年年AbrahamAbraham等分等分别分离出青霉素母核别分离出青霉素母核6-APA6-APA（6-6-氨基青霉烷氨基青霉烷酸）和头孢菌素母核酸）和头孢菌素母核7-ACA(7-7-ACA(7-氨基头孢烷氨基头孢烷酸），开创了酸），开创了半合成半合成-内酰胺类内酰胺类抗菌药物抗菌药物的新时代。的新时代。 19731973年，应用微生物筛选和青霉素结构改年，应用微生物筛选和青霉素结构改造获得造获得-内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂，有效地控制了，有效地控制了产酶菌引起的感染。产酶菌引起的感染。2022-4-269临床常用抗菌药物临床常用抗菌药

6、物2022-4-2610 -内酰胺类抗菌药物 氨基糖甙类抗菌药物 大环内酯类抗菌药物 四环素类抗菌药物 氯霉素类抗菌药物 林可酰胺类抗菌药物（作用机制似红霉素） 糖肽类抗菌药物（万古霉素等） 喹诺酮类抗菌药物 磺胺类抗菌药物（干扰叶酸合成，核酸合成受抑） 呋喃类抗菌药物(干扰氧化还原酶系统，代谢阻断）临床常用抗菌药物2022-4-2611 概念：化学结构式中具有内酰胺环的一大类抗菌药物。 抗菌作用机制：与细菌细胞膜上的青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins,PBPs)结合，抑制PBPs（有转肽酶等酶的作用）活性作用，进而抑制细菌细胞壁的合成。繁殖期杀菌 种类：青

7、霉素类、头孢菌素类、头霉素类、单环内酰胺类(monobactams)、碳青霉烯类抗菌药物(carbapenems)、内酰胺酶抑制剂。Beta-内酰胺类抗菌药物2022-4-2612青霉素结合蛋白青霉素结合蛋白(penicillins binding proteins, PBPs) 存在于所有细菌存在于所有细菌细胞膜细胞膜的表面，在细菌细胞的表面，在细菌细胞壁合成中主要起壁合成中主要起各种细胞壁合成酶各种细胞壁合成酶( (转糖基转糖基酶、转肽酶、酶、转肽酶、D-D-羧肽酶、内肽酶等羧肽酶、内肽酶等) )的作用，的作用，均是均是 - -内酰胺类抗菌药物潜在的靶标内酰胺类抗菌药物潜在的靶标。 其数量

8、、分子大小及与其数量、分子大小及与 - -内酰胺类抗菌药物内酰胺类抗菌药物的亲和力随细菌种类不同而不同。的亲和力随细菌种类不同而不同。2022-4-2613青霉素类青霉素类(Penicillins)抗菌药物抗菌药物 四个原子的四个原子的 - -内酰内酰胺环胺环和五个原子噻唑和五个原子噻唑环环 引入不用的基团有不引入不用的基团有不同的效应同的效应 有天然青霉素、耐酶有天然青霉素、耐酶青霉素、广谱（氨基青霉素、广谱（氨基组、羧基组、脲基组）组、羧基组、脲基组）青霉素青霉素 2022-4-2614Penicillins种类和抗菌活性种类和抗菌活性 耐青霉素酶青霉素耐青霉素酶青霉素 甲氧西林甲氧西林

9、methicillinmethicillin 苯唑西林苯唑西林 oxacillinoxacillin 氯唑西林氯唑西林 cloxacillincloxacillin等等天然青霉素天然青霉素 青霉素青霉素G G、青霉素、青霉素V V（不稳定不稳定） 作用于不作用于不产青霉素酶的革兰阳性球菌、革兰产青霉素酶的革兰阳性球菌、革兰阴性菌和厌氧性细菌。阴性菌和厌氧性细菌。2022-4-2615Penicillins种类和抗菌活性种类和抗菌活性 氨基组氨基组：作用于青霉素作用于青霉素G G敏感菌，大部敏感菌，大部分大肠埃希菌，奇异变形杆菌，流感嗜分大肠埃希菌，奇异变形杆菌，流感嗜血杆菌。包括血杆菌。包括氨

10、苄西林氨苄西林(ampcillin)、阿阿莫西林莫西林(amoxicillin) 。 羧基组：羧基组：作用于产作用于产 - -内酰胺酶内酰胺酶 肠杆菌科和假肠杆菌科和假单胞菌单胞菌 ，对氨苄西林无效的革兰阴性杆菌，对氨苄西林无效的革兰阴性杆菌 ，协，协同氨基糖苷类抗菌药物对肠球菌抑菌作用同氨基糖苷类抗菌药物对肠球菌抑菌作用, ,包括包括羧苄西林羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林替卡西林(ticarcillin)。广谱青霉素广谱青霉素2022-4-2616Penicillins种类和抗菌活性种类和抗菌活性 脲基组脲基组 ：对铜绿假单胞菌有抑制作用对铜绿假单胞菌有抑制作用, , 包括

11、包括美洛美洛西林西林(mezlocillin)(mezlocillin)、阿洛西林阿洛西林(azlocillin)(azlocillin)和和哌拉西林哌拉西林(piperacillin)(piperacillin)。 青霉素青霉素+ + - -内酰胺抑制剂内酰胺抑制剂 ：作用于产作用于产 - -内酰胺酶内酰胺酶的革兰阴性和阳性细菌。包括：的革兰阴性和阳性细菌。包括： 氨苄西林氨苄西林- -舒舒巴坦巴坦ampicillin-sulbactam(ampicillin-sulbactam(unasynunasyn););替卡西替卡西林林- -克拉维酸克拉维酸( (即替美丁即替美丁) )ticacil

12、lin-ticacillin-clavulanate(clavulanate(TimentinTimentin););阿莫西林阿莫西林- -克拉维酸克拉维酸( (即安美汀即安美汀) )amoxicillin-amoxicillin-clavulanate(clavulanate(AugmentinAugmentin););哌拉西林哌拉西林- -他唑巴坦他唑巴坦 piperacillin-tazobactampiperacillin-tazobactam。2022-4-26172022-4-2618 是一类广谱半合成抗菌药物，具有抗菌作用强、耐青霉素酶、临床疗效好、毒性低、过敏反应较青霉素类少见

13、等优点。 根据抗菌谱、对内酰胺酶的稳定性以及发现时间的先后将其分为四代四代。 抗菌作用 G菌 G-菌 1 1stst gen. cephalosporin gen. cephalosporin 2 2ndnd gen. cephalosporin gen. cephalosporin 3 3rdrd gen. cephalosporin gen. cephalosporin 4 4thth gen. Cephalosporin gen. Cephalosporin 5 5thth gen. gen. Cephalosporin Cephalosporin 头孢菌素类(cephalosporin

14、s)抗菌药物2022-4-2619Cephalosporins种类及抗菌活性种类及抗菌活性1st generation 对对革兰阳性菌革兰阳性菌有较强的作有较强的作用用, ,包括金黄色葡萄球菌、肺包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、炎链球菌、化脓性链球菌、厌氧链球菌厌氧链球菌, ,但对耐甲氧西林但对耐甲氧西林葡萄球菌葡萄球菌(MRS)(MRS)、肠球菌、耐、肠球菌、耐青霉素的肺炎链球菌耐药。青霉素的肺炎链球菌耐药。 对革兰阴性杆菌如大肠埃对革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌中度敏感希菌、克雷伯菌中度敏感, ,对对假单胞菌、变形杆菌、沙雷假单胞菌、变形杆菌、沙雷菌和肠杆菌属耐药。菌和肠

15、杆菌属耐药。作用菌作用菌头孢噻啶头孢噻啶( (cephaloridine，先锋，先锋2 2号号) )头孢噻吩头孢噻吩( (cephalothin，先锋先锋1 1号号) )头孢氨苄头孢氨苄( (cephalexin，先锋，先锋4 4号号) )头孢唑啉头孢唑啉( (cefazolin，先锋，先锋5 5号号) )头孢拉啶头孢拉啶( (cephradine, , 先锋先锋6 6号号) )头孢匹林头孢匹林( (cephaprin, , 先锋先锋8 8号号) )头孢羟氨苄头孢羟氨苄( (cefadroxil) )药名药名2022-4-2620Cephalosporins种类及抗菌活性种类及抗菌活性2nd

16、generation 对金黄色葡萄球对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌（包括耐感嗜血杆菌（包括耐氨苄西林菌株）活性氨苄西林菌株）活性强强 。多孢孟多多孢孟多（cefamandole)头孢呋辛头孢呋辛(cefuroxime,zinacef,西力西力欣欣)、头孢尼西、头孢尼西(cefonicid)头孢雷特头孢雷特(ceforanide)头孢克洛头孢克洛(Cefaclor,头孢氯氨苄头孢氯氨苄)头孢丙烯头孢丙烯(Cefprozil) 作用菌作用菌药名药名2022-4-2621Cephalosporins种类及抗菌活性种类及抗菌活性3rd generation 对对革兰阴性肠

17、杆菌科和革兰阴性肠杆菌科和铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌具有强大的抗具有强大的抗菌活性菌活性 ;对第一、二代头孢菌对第一、二代头孢菌素耐药的革兰阴性菌敏感素耐药的革兰阴性菌敏感 ;第第三代口服头孢菌素对革兰阴三代口服头孢菌素对革兰阴性及阳性菌具有更广谱的抗性及阳性菌具有更广谱的抗菌活性菌活性,但所有口服药对肠球但所有口服药对肠球菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌无抗菌活性菌无抗菌活性 。注射用注射用:头孢噻肟头孢噻肟 (cefotaxime,claforan,凯复隆凯复隆)头孢曲松头孢曲松(ceftriaxone,头孢三嗪头孢三嗪,菌必治菌必治)、头孢唑肟头孢唑肟(ceftizoxi

18、me,epocelin)头孢他啶头孢他啶(ceftazidime,fortum,复达欣复达欣)头孢哌酮头孢哌酮(cefoperazone,Cefobid,先锋必先锋必)口服用口服用:头孢克肟头孢克肟(cefixime)头孢布坦头孢布坦(ceftibuten)头孢迪尼头孢迪尼(cefdinir)头孢泊肟头孢泊肟(cefpodoxime) 作用菌作用菌药名药名2022-4-2622Cephalosporins种类及抗菌活性种类及抗菌活性4th generation对葡萄球菌抗菌活性强，对葡萄球菌抗菌活性强，对产对产ESBL和和AmpC酶的酶的革兰阴性菌效果好。革兰阴性菌效果好。 头孢匹罗头孢匹罗(

19、cefpirome)头孢吡肟头孢吡肟(cefepime)头孢噻利（头孢噻利（cefoselis)等等作用菌作用菌药名药名2022-4-2623 作用：作用：能抑制内酰胺酶的活性，与内酰胺类抗菌药物联用能增强后者的抗菌活性。 种类：种类：主要有舒巴坦（sulbactam)、克拉维酸(clavulanic)、三（他）唑巴坦(tazobactam)。内酰胺酶抑制剂2022-4-2624内酰胺类抗菌药物作用机制2022-4-26252022-4-2626 作用机制：作用于细菌体内的作用机制：作用于细菌体内的核糖体核糖体30S30S小亚小亚基，基，抑制细菌蛋白质抑制细菌蛋白质的合成，并的合成，并破坏细菌

20、细胞破坏细菌细胞膜的完整性膜的完整性。 种类：链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉种类：链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那、奈替米星等素、丁胺卡那、奈替米星等 副作用：副作用：肾毒性和耳毒性肾毒性和耳毒性 抗菌谱：主要为抗菌谱：主要为革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌，链球菌和肠球，链球菌和肠球菌对其天然耐药。菌对其天然耐药。氨基糖苷类(aminoglycosides)2022-4-2627 作用机制：作用于细菌核糖体50S大亚基，通过阻断转肽作用和mRNA位移而抑制细菌蛋白质合成。 种类： 不良反应：主要不良反应为胃肠道反应。 抗菌谱：革兰阳性菌和少数革兰阴性菌，对支原体、衣原体、螺旋体等有

21、良好的作用。大环内酯类（macrolides）2022-4-2628 作用机制：药物与细菌体内作用机制：药物与细菌体内30S30S核糖体亚单位核糖体亚单位在在A A位上特异性结合，阻止氨基酰位上特异性结合，阻止氨基酰-tRNA-tRNA与与mRNAmRNA核糖体核糖体的受位位点结合，从而的受位位点结合，从而抑制肽链延长和蛋白质合抑制肽链延长和蛋白质合成成。此外，药物可引起细菌。此外，药物可引起细菌细胞膜通透性的改变细胞膜通透性的改变，使胞内的核苷酸和其他重要使胞内的核苷酸和其他重要成分外漏成分外漏，迅速抑制，迅速抑制DNADNA的复制。的复制。 种类：种类： 副作用：胃肠道反应，对儿童的牙齿和

22、骨骼的发副作用：胃肠道反应，对儿童的牙齿和骨骼的发育有影响。育有影响。 抗菌谱：对抗菌谱：对革兰阳性菌革兰阳性菌的作用优于革兰阴性菌，的作用优于革兰阴性菌，对支原体、衣原体、立克次体、螺旋体等有效。对支原体、衣原体、立克次体、螺旋体等有效。肠球菌耐药。肠球菌耐药。四环素类(tetracyclines)2022-4-2629 作用机制：作用于细菌作用机制：作用于细菌70S70S核糖体的核糖体的50S50S亚亚基基，抑制转肽酶，使肽链的伸长受阻，从，抑制转肽酶，使肽链的伸长受阻，从而而抑制菌体蛋白的合成抑制菌体蛋白的合成。 抗菌谱：抗菌谱：广谱广谱抑菌剂，对革兰阴性菌的作抑菌剂，对革兰阴性菌的作用

23、较革兰阳性菌强。用较革兰阳性菌强。 副作用：骨髓抑制、再生障碍性贫血等等副作用：骨髓抑制、再生障碍性贫血等等氯霉素类(chloramphenicols)2022-4-2630 抗菌机制：拮抗细菌的DNA旋转酶，从而阻断细菌DNA的复制而产生快速杀菌作用。 种类：临床上常用的为氟喹诺酮类药物 抗菌谱：革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌 不良反应：主要为消化道反应，其次是神经系统反应。喹诺酮类(quinolones)2022-4-2631抗菌药物敏感性试验抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility test，AST)目的：1.1.预测抗菌治疗效果（预测抗菌治疗效果（S S

24、、R R、I I）2.2.指导抗菌药物的临床应用指导抗菌药物的临床应用3.3.发现或提示细菌耐药机制的存在发现或提示细菌耐药机制的存在4.4.监测细菌耐药性、分析其变迁监测细菌耐药性、分析其变迁2022-4-2632如何进行抗菌药物选择？如何进行抗菌药物选择？我国根据美国我国根据美国NCCLSNCCLS（National National committee for clinical laboratory committee for clinical laboratory standardsstandards，NCCLSNCCLS），），20052005年后年后称称CLSICLSI（Clini

25、cal and laboratory standards Clinical and laboratory standards institute)institute)制定的标准进行。制定的标准进行。2022-4-2633抗菌药物的选择抗菌药物的选择CLSI将抗菌药物的选择分成五组：A A组：对特定菌群常规测试并常规报告的抗菌药物。B B组：对于临床重要的，特别是针对医院感染的药物，常规测试但选择性报告的抗菌药物。2022-4-2634B B组药物报告指征1. 对A组药物过敏、耐受或无效的菌株。2. 特定标本来源的菌种：如脑脊液中肠杆菌科细菌报告对三代头孢的敏感性，对泌尿道的分离肠杆菌株报告TM

26、P/SMZ结果。3. 多种细菌感染。4. 不同病原菌多部位感染。5. 为流行病学调查目的向感染控制组报告。2022-4-2635C C组：替代或补充性抗菌药物，选择性报告的药物。可以在以下情况下进行C组药物试验：1. 对基本（A、B组）药物耐药或过敏的菌株2. 少见菌的感染3. 为流行病学目的向感染控制组报告。2022-4-2636U U组：仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物。 除泌尿道，其他感染部位分离出的病原菌不用此组药物。O O组（Other）：对检测菌有临床指征、但一般不允许常规试验和报告的药物。Inv组（Investigation）：做研究用但尚未得到FDA批准的药物。2022-4-26

27、372022-4-26382022-4-2639药敏结果的判断？依据依据CLSICLSI的标准进行判断的标准进行判断2022-4-2640结果判断(CLSI的定义)敏感（敏感（SusceptibleSusceptible，S S）药物常规用量给药治疗有效药物常规用量给药治疗有效菌株能被测试药物常规剂量使用时在感染部菌株能被测试药物常规剂量使用时在感染部位可达到的抗菌药物浓度所抑制位可达到的抗菌药物浓度所抑制。耐药（耐药（Resistant, Resistant, R R）药物常规用量给药治疗不能抑制细菌的生长药物常规用量给药治疗不能抑制细菌的生长即菌株不被测试药物常规剂量在感染部位可即菌株不被

28、测试药物常规剂量在感染部位可达到的药物浓度所抑制。达到的药物浓度所抑制。2022-4-2641结果判断中介中介 (Intermediate,(Intermediate,I)I)中等敏感-菌株对药物的敏感性低于敏感株抗菌药物在生理浓集的部位具有临床效力 药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误2022-4-26422022-4-26432022-4-2644药敏试验常用的方法 纸片扩散法（Disk diffusion） 稀释法（Dilution Test） 肉汤稀释法（常量法和微量法） 琼脂稀释法 E试验2022-4-2645202

29、2-4-2646纸片扩散法（纸片扩散法（K-B K-B 法）原理与方法法）原理与方法抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度并与该抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度并与该药对测试菌的药对测试菌的 MIC MIC 呈负相关关系呈负相关关系将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上菌的琼脂平板上 纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度周围扩散形成递减的梯度浓度在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制从在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制从而形成无菌生长的

30、而形成无菌生长的透明圈透明圈即为抑菌圈即为抑菌圈2022-4-2647涂布接种细菌涂布接种细菌2022-4-26482022-4-2649纸片扩散法具体步骤1.水解酪蛋白（水解酪蛋白（MH）培养基，培养基，pH7.27.4，制备成，制备成琼脂厚琼脂厚度度4mm的平板；的平板；2.挑取孵育挑取孵育16 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准麦氏标准。 2022-4-2650纸片扩散法具体步骤3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；4.然然后在后在M

31、H琼脂表面均匀涂布接种琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板次，每次旋转平板60度度；5.最后沿平板内缘涂抹最后沿平板内缘涂抹1周周；6.平板在室温下干燥平板在室温下干燥35min，用无菌镊子或商品化的纸片分，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于各纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于，纸片距平板内缘大于15mm。2022-4-2651纸片扩散法具体步骤7.35孵育孵育1624小时量取小时量取抑菌圈直径；抑菌圈直径；8.根据抑菌环的直径，按照根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、标准判读，报告敏感、中介、

32、耐药。中介、耐药。2022-4-26522022-4-2653抗菌药物纸片：抗菌药物纸片：直径直径6.0-6.35mm6.0-6.35mm，吸水量为，吸水量为 20l20l的滤纸。的滤纸。 培培 养养 基：基：MHMH琼脂，琼脂，pH7.2-7.4pH7.2-7.4，琼脂，琼脂 厚度厚度4mm 4mm 菌液浓度和接种：菌液浓度和接种：0.50.5麦氏浊度麦氏浊度，15min15min内内接接 种完毕。种完毕。 结果判断与报告结果判断与报告：S S（敏感）、（敏感）、I I（中介）、（中介）、 R R（耐药）（耐药） 质质 控：控：采用采用标准菌株进行标准菌株进行 药敏质控药敏质控。纸片扩散法材

33、料与判断2022-4-26542022-4-2654纸片扩散法影响因素接种菌量纸片抗菌药物含量、有效性培养基成分、琼脂的厚度孵育温度、时间2022-4-2655质量控制：采用质控菌株质量控制：采用质控菌株 肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌：大肠埃希菌：大肠埃希菌ATCC25922 ATCC35218 铜绿假单胞菌：铜绿假单胞菌：大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922 ATCC35218 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌ATCC27853 不不 动动 杆杆 菌菌 等：等： 大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922 ATCC35218 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌ATCC27853 葡葡 萄萄 球球 菌菌 属：属：金黄

34、色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC25923 大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC35218 肠肠 球球 菌菌 属：属：粪肠球菌粪肠球菌ATCC29212 纸片扩散法2022-4-2656（一）肉汤稀释法用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释后,再接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀灭待测细菌的最低抑菌浓度（ minimal inhibitory concentration ， MICMIC）或最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration, MBCMBC）。（二）琼脂稀释法将不同浓度抗菌药物分别混匀于琼脂培养基中，配制出含各种浓度药物的平板，使用微量多头接种器接种细菌

35、，孵育后观察细菌在含不同浓度药物的平板上的生长情况，以抑制细菌生长的平板所含的药物浓度测得最低抑菌浓度（MIC)2022-4-2657 培养基：CLSI推荐调节了钙离子浓度的MH肉汤，pH 7.2-7.4 药物稀释： 药物原液：用直接购于药厂的高纯度药粉配置，浓度不低于1000g/ml或10倍于最高测试浓度，-60储存，不超过6个月 稀 释 液：蒸馏水、磷酸盐缓冲液、NS等 药物的稀释：2倍稀释 菌种终浓度：5105 CFU/ml（用0.5麦氏浊度菌液稀释） 结果判断：在试管或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最小抑菌浓度（MIC）。肉汤稀释法2022-4-2658抗菌药物抗菌药物2倍系列

36、稀倍系列稀释释滴加定量菌液滴加定量菌液2022-4-2659 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.1252022-4-26602022-4-2661 培养基：MH琼脂，pH7.27.4 含药琼脂的配制：药物溶液与培养基的比为1:9，琼脂厚度34mm 菌液浓度：0.5麦氏浊度菌液稀释10倍，多头接种器接种（每接种点细菌数为1104 CFU）。 结果判断：MIC，MIC50、MIC90琼脂稀释法2022-4-2662被测菌在含定量药物的琼脂上生长被测菌在含定量药物的琼脂上生长2022-4-2663琼脂稀释法 药物浓度 4 8 16 32 64 ug/ml 制备含对倍抗菌药物浓度

37、梯度的平板，制备菌悬液，点种菌，104CFU/每个点，孵育，判读结果2022-4-2664 MIC50:抑制50%试验菌株的最低药物浓度。 MIC90:抑制90%试验菌株的最低药物浓度。2022-4-26652022-4-2665琼脂稀释法优点：金标准 精确可靠可同时测定多株菌（60株）细菌生长情况可查缺点： 测多个药时劳动强度大制备平皿费时费力2022-4-2666 E 试验（Epsilometer test） 是一种结合了稀释法和扩散法的原理和特点测定细菌对抗菌药物的敏感度的定量技术。 原理：E试条是一种宽5mm、长50mm的商品化塑料试条，一面固定有干化、稳定的、浓度呈连续指数分布的抗菌

38、药物，另一面有药物的浓度刻度读数（g/ml）。抗菌药物梯度范围一般为15-20个自然对数。2022-4-2667E试验原理(MIC,g/ml)2022-4-2668 细菌的接种和加样：同K-B法 厚度4mm的MH平板，用0.5麦氏浊度的菌液涂布接种，直径9cm的平板可放两条药敏试验条。 结果判断与报告：同稀释法2022-4-26692022-4-26702022-4-26712022-4-2671E test 法 优点连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好影响因素少，稳定性高操作简单，省时 缺点：昂贵 用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，分枝杆菌2022-4-2672联合药敏试验一、棋盘稀释法

39、联合药敏试验（定量）二、联合药敏实验结果：1、无关作用(联合活性等于单独活性）2、拮抗作用（联合活性低于单独活性）3、累加作用：联合活性等于单独活性相加。4、协同作用：联合活性显著大于单独活性的总和2022-4-2673细菌的耐药性和产生机制 细菌的耐药性：天然耐药、获得性耐药 细菌获得性耐药产生的机制：1、产生水解酶、修饰酶 -内酰胺酶的产生（水解酶） 修饰酶等的产生（氨基糖甙类修饰酶 氯霉素乙酰转移酶、 红霉素酶和其他灭活酶） 2、药物作用靶位的改变（PBP、核糖体等） 3、抗菌药物渗透障碍（外膜孔蛋白减少、生物膜 的形成） 4、药物泵出（主动外排泵）2022-4-2674细菌耐药性的检测

40、方法（自学）一、耐药性表型检测 1、-内酰胺酶检测 2、超广谱内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs) 、AmpC酶、碳青霉烯酶的检测 3、MRS的检测 4、D试验可诱导的克林霉素耐药试验 5、氨基糖苷类高水平耐药和万古霉素耐药肠球菌的检测二、耐药基因检测：PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP 、DNA测序等 2022-4-2675克林霉素诱导耐药葡萄球菌 红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。 *或其他大环内酯类2022-4-2676机制机制耐药基因耐药基因红霉素红霉素克林霉素克林霉素核

41、糖体修饰核糖体修饰- -药物不能药物不能结合于靶位结合于靶位ermermR RS S* *R RR R结构性结构性泵泵- -药物被泵出药物被泵出msrmsrA AR RS Sermerm= erythromycin ribosome methylase= erythromycin ribosome methylasemsrAmsrA= macrolide streptogramin resistance= macrolide streptogramin resistance* *需要诱导来显示耐药性需要诱导来显示耐药性红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制2022-4-2677对于红霉素耐药、克

42、林霉素敏感的葡萄球菌，需检测诱导性克林霉素耐药 注意注意试验试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌( (苯唑西林敏感苯唑西林敏感和耐药株和耐药株) )；对于对于CONSCONS，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌；疗凝固酶阴性葡萄球菌；大多数医院相关大多数医院相关MRSAMRSA是克林霉素耐药的；是克林霉素耐药的；大多数社区相关大多数社区相关MRSAMRSA是克林霉素敏感的是克林霉素敏感的( (msrmsrA A 基因型基因型) )；克林霉素可以口服给药。克林霉素可以口服给药。2022-4-267

43、8诱导性克林霉素耐药（诱导性克林霉素耐药（ermerm介导）介导）葡萄球菌-“D试验”患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药无克林霉素诱导（无克林霉素诱导（msrA介导）介导）真的克林霉素敏感真的克林霉素敏感- -报告克林霉素敏感报告克林霉素敏感“D”2022-4-2679葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法2022-4-26802022-4-2681肠球菌肠球菌高水平氨基糖苷类耐药筛查高水平氨基糖苷类耐药筛查 纸片扩散法纸片扩散法120 120 g g 庆大霉素庆大霉素; 300 ; 300 g g 链霉素链霉素抑菌圈抑菌圈10 mm = 10 mm = 高水平氨基糖苷类耐药高水平

44、氨基糖苷类耐药 MICMIC筛查筛查庆大霉素庆大霉素: 500 : 500 g/ml g/ml 链霉素链霉素: 1000 : 1000 g/ml (g/ml (肉汤肉汤) ) 2000 2000 g/ml (g/ml (琼脂琼脂) )2022-4-2682肠球菌氨基糖苷类修饰酶 链霉素链霉素 庆大霉素庆大霉素 妥布霉素妥布霉素 阿米卡星阿米卡星/ /丁胺卡那丁胺卡那6-AAD + - - -3APH - - - +2”APH/6AAC - + + +6AAC* - - + + * * 在所有屎肠球菌中均发现在所有屎肠球菌中均发现 + = + = 酶可以修饰药物；药物无协同性酶可以修饰药物；药物

45、无协同性- = - = 酶不能修饰药物；药物有协同性酶不能修饰药物；药物有协同性2022-4-2683万古霉素耐药肠球菌检测（琼脂法）：万古霉素耐药肠球菌检测（琼脂法）：培养基：含6g/ml万古霉素的MH琼脂接种：0.5麦氏浊度的肠球菌悬液1-10 l点种。孵育：35空气中孵育24h结果判断：出现一个以上的菌落待测菌为VRE。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212(敏感） 粪肠球菌ATCC51299(耐药）2022-4-2684万古霉素耐药肠球菌（VRE）表型VREVRE屎肠球菌中居多屎肠球菌中居多vanvanA A - - 高水平耐药高水平耐药(MIC (MIC 256 256 g/ml)g/

46、ml)vanvanB B - - 中等水平耐药中等水平耐药 (MIC 16 - (MIC 16 - 256 256 g/ml)g/ml) 低水平万古霉素耐药低水平万古霉素耐药vanvanC - (MIC 2 - 16 C - (MIC 2 - 16 g/ml)g/ml)vanCvanC天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌菌株不引起院内爆发，菌株不引起院内爆发，vanCvanC基因不易于传播基因不易于传播纸片扩散法实验可能检测不出纸片扩散法实验可能检测不出2022-4-2685超广谱-内酰胺酶（ESBLs） ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环内

47、酰胺类氨曲南的一类酶； ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制； ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。2022-4-2686纸片扩散法检测纸片扩散法检测ESBLS:ESBLS: 项项 目目 初步筛选初步筛选试验试验 表型确证表型确证试验试验培养基培养基 MH琼脂琼脂 MH琼脂琼脂抗菌药物纸片浓度抗菌药物纸片浓度 头孢泊肟头孢泊肟10 g 头孢他啶头孢他啶30 g 头孢他啶头孢他啶30 g 头孢他啶头孢他啶/棒酸棒酸30/10 g 氨

48、曲南氨曲南30 g 和和 头孢噻肟头孢噻肟30 g 头孢噻肟头孢噻肟30 g 头孢曲松头孢曲松30 g 头孢噻肟头孢噻肟/棒酸棒酸30/10 g接种接种 按标准纸片扩散法的规定进行按标准纸片扩散法的规定进行孵育条件孵育条件 35 C, 空气空气孵育时间孵育时间 1618h结果判读结果判读 头孢泊肟头孢泊肟 17mm 对对2个中任何一个药个中任何一个药 头孢他啶头孢他啶 22mm 物物,加棒酸后加棒酸后,抑菌环直抑菌环直 氨曲南氨曲南 27mm 径与不加棒酸的抑菌径与不加棒酸的抑菌 头孢噻肟头孢噻肟 27mm 环相比，增大值环相比，增大值 5mm 头孢曲松头孢曲松 25mm 时时,判定为判定为E

49、SBL产生产生 意味着可疑有意味着可疑有ESBL 2022-4-2687ESBLs初筛和确证试验双纸片协同试验初筛双纸片协同试验初筛ESBLs表型确证试验检测表型确证试验检测ESBLsESBLs初筛试验初筛试验2022-4-2688超广谱-内酰胺酶（ESBLs） 稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBLs： 头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC2mg /mL 或头孢泊肟MIC8mg /mL 2022-4-2689超广谱-内酰胺酶（ESBLs） 稀释法（表型确认试验） 头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。 任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MI

50、C降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。 2022-4-2690检测检测ESBLs2022-4-2691AmpC酶的特征 AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的型内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。 与ESBLs不同的是，产AmpC酶细菌对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。 2022-4-2692AmpC酶的检测方法 头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法； 除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpC Disk、头孢西丁琼脂基础法等。 2022-4-