叶绿体的分离及荧光观察课件.ppt

1、生物绘图生物绘图1 1要求：细胞和组织要求：细胞和组织绘图是根据显微镜下的绘图是根据显微镜下的观察内容绘制的，因此观察内容绘制的，因此，首先要充分观察了解，首先要充分观察了解所绘材料的特点、排列所绘材料的特点、排列及比例。选择有代表性及比例。选择有代表性的、典型的部位进行绘的、典型的部位进行绘图。客观真实地反映材图。客观真实地反映材料的自然状态。即生物料的自然状态。即生物绘图要求具备高度的科绘图要求具备高度的科学性和真实感，形态正学性和真实感，形态正确、比例适当、清晰美确、比例适当、清晰美观。观。2 2、用线条和圆点来完、用线条和圆点来完成全图。如，用线条描成全图。如，用线条描绘细胞壁与膜。绘

2、细胞壁与膜。用用“点点”表示明暗表示明暗和颜色的深和颜色的深浅，给予立体感浅，给予立体感3 3、不要只孤独的绘制、不要只孤独的绘制一个细胞，要表现出显一个细胞，要表现出显微镜下还有其他细胞的微镜下还有其他细胞的存在，存在，关于实验报告问题1 1、0.17mol/LNaCl0.17mol/LNaCl能促进细胞质流动（旱生与水生植物有区别）能促进细胞质流动（旱生与水生植物有区别）2 2、0.35mol/LNaCl0.35mol/LNaCl如果使这两种细胞产生质的话，就不是这两种细胞如果使这两种细胞产生质的话，就不是这两种细胞的等渗浓度。的等渗浓度。3 3、用不同浓度的丙二酸钠处理时，如果细胞没有产

3、生质壁分离，但、用不同浓度的丙二酸钠处理时，如果细胞没有产生质壁分离，但细胞质流动还是减慢或停止，就说明此种浓度的丙二酸钠有竞争性抑细胞质流动还是减慢或停止，就说明此种浓度的丙二酸钠有竞争性抑制作用，但如果在看到某种浓度的丙二酸钠处理时，细胞产生了质壁制作用，但如果在看到某种浓度的丙二酸钠处理时，细胞产生了质壁分离，那就说明这种浓度的丙二酸钠是一种高渗液，细胞质停止流动分离，那就说明这种浓度的丙二酸钠是一种高渗液，细胞质停止流动更大程度上是由渗透压引起的？（请思考）更大程度上是由渗透压引起的？（请思考）4 4、氧化磷酸化抑制剂可分为三类，即呼吸抑制剂、磷酸化抑制剂和、氧化磷酸化抑制剂可分为三类

4、，即呼吸抑制剂、磷酸化抑制剂和解偶联剂。解偶联剂。 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，是光合作用叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，是光合作用的重要场所，的重要场所， 由于具有这一重要功能，所以叶绿体一直由于具有这一重要功能，所以叶绿体一直是细胞生物学、遗传学和分子是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。生物学的重要研究对象。 细胞器是细胞质中具有一定结构和功细胞器是细胞质中具有一定结构和功能的微结构，在细胞生命活动中扮演着重能的微结构，在细胞生命活动中扮演着重要角色。对其要角色。对其结构和功能的研究结构和功能的研究, ,是细胞生是细胞生物学的基本课题物学的基本课题, ,其重

5、要的研究手段之一是其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分分离纯的亚细胞组分, ,观察它们的结构观察它们的结构或进或进行生化分析。行生化分析。 细胞器分离的过程包括两个主细胞器分离的过程包括两个主要阶段：要阶段：破碎细胞破碎细胞和和细胞组分的分离细胞组分的分离。 常用的细胞破碎方法常用的细胞破碎方法方方法法技术技术 原理原理效效果果成本成本举例举例机机械械法法匀浆法匀浆法细胞被搅拌器劈碎或细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎受剪切力而破碎适中适中适中适中动植物组织或细胞动植物组织或细胞研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中便宜便宜植物组织植物组织超声波法超声波法用超声波的空穴作用用超

6、声波的空穴作用使细胞破碎使细胞破碎剧烈剧烈昂贵昂贵细胞悬浮液小规模处理细胞悬浮液小规模处理珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠细胞被玻璃珠或铁珠捣碎捣碎剧烈剧烈便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞细胞悬浮液和植物细胞大规模处理大规模处理化化学学法法渗透冲击渗透冲击渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞温和温和便宜便宜血红细胞的破坏血红细胞的破坏酶消化法酶消化法细胞壁或细胞膜被消细胞壁或细胞膜被消化，使细胞破碎化，使细胞破碎温和温和昂贵昂贵动植物细胞动植物细胞增溶法增溶法表面活性剂溶解细胞表面活性剂溶解细胞膜膜温和温和适中适中破碎大肠杆菌破碎大肠杆菌脂溶法脂溶法有机溶剂溶解细胞壁有机溶剂溶解细胞壁适中适中便宜便

7、宜甲苯破碎酵母细胞甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱处理法碱的皂化作用使细胞碱的皂化作用使细胞壁溶解壁溶解剧烈剧烈便宜便宜破碎大肠杆菌破碎大肠杆菌细细细细细细 胞胞胞胞胞胞 器器器器器器 分分分分分分 离离离离离离细细细细细细 胞胞胞胞胞胞 器器器器器器 分分分分分分 离离离离离离 差速离心方法较简单，但分辨差速离心方法较简单，但分辨率不高，率不高，在同一个数量级在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。其他分离手段之前的粗制品提取。 用一定的介质在离心管内形成一连用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆续或不连续的密

8、度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。这类分离又可分为离的方法。这类分离又可分为速率速率- -区区带梯度离心带梯度离心和和等密度梯度离心等密度梯度离心两种。两种。 优点是一次离心可优点是一次离心可分离提纯样品中几分离提纯样品中几种组份，用于较精种组份，用于较精细的分离。但成本细的分离。但成本与技术要求高与技术要求高原理：原理：根据分离的粒子在梯根据分离的粒子在梯度液中度液中，通通过离心力场的作用，使不同过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成的颗粒在密度梯度层内形成一系

9、列区带，从而达到彼此一系列区带，从而达到彼此分离的方法。分离的方法。A、速率、速率-区带梯度离心流程图区带梯度离心流程图B、等密度梯度离心流程图、等密度梯度离心流程图原理：原理：根据不同颗粒在密度梯度根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着介质中存在着，在离，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。颗粒得到分离的方法。 两种密度梯度离心方法的异同两种密度梯度离心方法的异同 特特 点点速率速率

10、- -区带梯度离心区带梯度离心等密度离心等密度离心分离方法的主要依据分离方法的主要依据主要依赖主要依赖分离的粒子在梯度分离的粒子在梯度液中液中依赖于样品颗粒的依赖于样品颗粒的不同密度不同密度来进行离来进行离心分离的心分离的 介质密度梯度选择介质密度梯度选择 最大密度必须小于样品中粒最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平缓子的最小密度；梯度平缓覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度较高较高 离心介质的主要作用离心介质的主要作用减缓颗粒扩散速度减缓颗粒扩散速度阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒适用性适用性由于此法是一种不完全的沉由于此法是一种不

11、完全的沉降，沉降受物质本身大小的降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在影响较大，一般是应用在物物质大小相异而密度相同质大小相异而密度相同的况。的况。 此法一般应用于此法一般应用于物质的大小相近，而物质的大小相近，而密度差异较大密度差异较大时。常用的梯度液是时。常用的梯度液是CsClCsCl。 离心后区带形成位置离心后区带形成位置易变易变( (样品易扩散）样品易扩散）不变（样品不扩散）不变（样品不扩散）影响样品区带形成的主要因影响样品区带形成的主要因素素离心时间（过长或过短都不离心时间（过长或过短都不利）利）颗粒样品颗粒样品密度密度一般操作方法一般操作方法介质梯度应预先形成介质梯度应预先

12、形成 ，离离心前将样品小心铺放在密度心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面、底部或中间，梯度溶液表面、底部或中间，离心后形成区带。离心后形成区带。 介质梯度不需预先制备，介质梯度不需预先制备，离心时把密离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离度均一的介质液和样品混合后装入离心管，心管，通过离心自形成梯度，通过离心自形成梯度，让颗粒让颗粒在梯度中进行再分配。在梯度中进行再分配。常用介质常用介质FicollFicoll、PercollPercoll及蔗糖、及蔗糖、甘油甘油蔗糖蔗糖 、甘油、甘油、 CsClCsCl、硫酸铯、溴化硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。铯、三碘苯衍生物等。 表表1:各种亚细胞

13、构造在各种亚细胞构造在不同的离心介质不同的离心介质中分离所需的中分离所需的离心力与时间离心力与时间50% 细胞核细胞核800-1000g 10min500g 10min4000g 60min 线粒体线粒体10,000g20min5000g 10min80000g100min 溶酶体溶酶体10,000g20min5000g 10min80000g100min质膜质膜(大片大片)100,000g15min100,000g100min 150,000g600min内质网片段内质网片段150,000g40min1000g20min100,000g200min微粒体微粒体100,000g60min10,

14、000g30min100,000g360min小颗粒小颗粒100,000g60min各种细胞器、大分子和病毒的各种细胞器、大分子和病毒的密度密度及相应的及相应的沉降系数沉降系数图图:各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数沉降系数 根据根据1924年年Svedberg（离心法创（离心法创始人始人-瑞典蛋白质化学家）对沉降瑞典蛋白质化学家）对沉降系数下的定义：系数下的定义：颗粒在单位离心力颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。场中粒子移动的速度。以每单位重以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为力的沉降时间表示，并且通常为120010-13秒范围，秒范围，

15、10-13这个这个因子叫做沉降单位因子叫做沉降单位S,即即1S=10-13秒秒离心力与离心机转速转换公式：离心力与离心机转速转换公式：图图2:离心力与离心机转数的转换列线图离心力与离心机转数的转换列线图RCF1.11810-5r(n) (g) 式中式中,RCF表示相对离心力表示相对离心力,单位是重力单位是重力加速度加速度g（980厘米厘米/秒秒2）, (g)表示表示重力重力加速度的倍数加速度的倍数,r 为离心转子的半径距离，指为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；厘米；n为转子每分钟的转数（为转子每分钟的转数（rpm）。）。

16、r=8cmn=15,000rpmRCF20,000g一、荧光显微镜一、荧光显微镜(Fluorescence microscope)结构组成结构组成落射荧光装置落射荧光装置:电源箱电源箱220V作为一种激发标本作为一种激发标本内的荧光物质的能内的荧光物质的能源，除了产生紫外源，除了产生紫外线外，还能产生各线外，还能产生各种波长的可见光和种波长的可见光和大量的热大量的热汞灯灯箱汞灯灯箱100W/DC集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体.1.两组光源:透射照明光源(卤素灯)；荧光光源(超高压直流汞灯或氙灯)；2.有特殊的滤光片:3.激发光波长：较短，因此，分辨力高于普通显微镜；4.

17、荧光光源荧光光源照明方式：通常为落射式。紫外光紫外光(UV)：激发光谱区域：激发光谱区域：330-400nm; 紫光紫光(V)：激发光谱区域：激发光谱区域：395-415nm;蓝光蓝光(B)：激发光谱区域：激发光谱区域：420-485nm;绿光绿光(G)：激发光谱区域：激发光谱区域：460-550nm ；二、荧光显微镜的二、荧光显微镜的 特点：特点：图：落射式荧光显微镜的光路图：落射式荧光显微镜的光路三、荧光显微镜的成像原理三、荧光显微镜的成像原理 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光（，其基本原理是利用一定波长的激发光

18、（如紫外如紫外光和蓝光等光和蓝光等）对样品进行激发，使之产生一定波）对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。性、定位、定量观察检测。什么是什么是荧光荧光 ?四、荧光的性质四、荧光的性质保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性荧光波长激发波长荧光波长激发波长荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减有不同程度的衰减荧光强度取决于荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度激发光强度、被检物浓度、荧光效率、荧光效率 用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断等。Fluo

19、rescence image of epithelial cell,DNA in blue and Microtubules in green五、荧光显微术应用五、荧光显微术应用六、注意事项六、注意事项荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行；荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行；使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛。使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛。汞灯开启后汞灯开启后10min达到最大效率，在达到最大效率，在15min内不要关灯，有助于保护灯的内不要关灯，有助于保护灯的寿命，一旦关灯须等寿命，一旦关灯须等3min后才能重新开启。后才能重新开启。凡是荧光染

20、料都有一定毒性，请做好防护。凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍有必要时立即拍照。照。 荧光亮度的判断标准：荧光亮度的判断标准：一般分为四级一般分为四级，即，即“一一”无或可见微弱荧光。无或可见微弱荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。可见有明亮的荧光。“+”可可见耀眼的荧光。见耀眼的荧光。 实验原理实验原理叶绿

21、体的分离应在叶绿体的分离应在等渗溶液等渗溶液(0.35mol/L(0.35mol/L氯化钠氯化钠或或0.4mol/L0.4mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液) )中进行中进行, , 以免渗透压的改变以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。利用差速离心法将匀浆液离使叶绿体受到损伤。利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。分离过程最好在心，从而使叶绿体得到分离。分离过程最好在0 055的条件下进行；如果在室温下，要迅速分的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。离和观察。 有些生物体内的物质受激发光照射后有些生物体内的物质受激发光照射后直接发直接发出荧光，称为自发荧光出荧光，称为自发荧光( (或直

22、接荧光或直接荧光) )，如叶绿素如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光能发出荧光，这种荧光称为次生荧光( (或间接荧光或间接荧光) )，如让叶绿素的自发荧光淬灭后，叶绿体也可吸如让叶绿素的自发荧光淬灭后，叶绿体也可吸附吖啶橙后发桔红色荧光。本实验附吖啶橙后发桔红色荧光。本实验利用荧光显微利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。镜对叶绿体的荧光进行观察。实验材料与试剂实验材料与试剂材料：菠菜叶片 试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯

23、化钠溶液， 0.01%吖啶橙吖啶橙(AO)(AO) ：仪器：普通离心机，研钵,天平，荧光显微镜，显微镜，镊子，目镜测微尺，物镜测微尺，培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，载片，盖玻片，离心管,吸水纸等配制方法：配制方法：称取称取0.1g0.1g吖啶橙加蒸馏水吖啶橙加蒸馏水100ml100ml做干液，放冰箱备做干液，放冰箱备用，临用，临 用前取用前取1ml1ml干液加干液加1/15mol/L1/15mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH4.8pH4.8）9ml9ml。吖啶橙(acridine orange，AO ) 吖啶橙吖啶橙是一种是一种芳香杂环阳离子芳香杂环阳离子染料可染料可透过细胞膜，不同浓度

24、与透过细胞膜，不同浓度与pHpH的的吖啶橙溶液所吖啶橙溶液所呈现的荧光颜色不同，这与其结构不同有关。呈现的荧光颜色不同，这与其结构不同有关。吖啶橙吖啶橙与物质的结合一般有两种方式，潜入与物质的结合一般有两种方式，潜入到物质结构中或由静电吸引堆积在物质表到物质结构中或由静电吸引堆积在物质表面，如面，如DNADNA和和RNARNA都能与都能与吖啶橙吖啶橙结合的，在紫结合的，在紫外光或蓝光外光或蓝光(330(330485nm)485nm)激发下，激发下，DNADNA可被激可被激发出发出530nm530nm的荧光发射峰，的荧光发射峰，RNARNA可被激发出可被激发出640nm640nm的的荧光发射峰，

25、因此，荧光发射峰，因此，细胞核细胞核发发亮绿色亮绿色荧光，荧光，核仁和核仁和胞质胞质RNARNA发发桔红色桔红色荧光。之所以有两种不同荧光的荧光。之所以有两种不同荧光的产生是由于产生是由于吖啶橙吖啶橙与与双链双链DNADNA 和和单链单链DNADNA或或RNARNA的结的结合方式不同而决定的。它与合方式不同而决定的。它与DNADNA结合是潜入双链之结合是潜入双链之间，而与间，而与单链单链DNADNA或或RNARNA的结合则由静电吸引堆积在的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上。磷酸根上。叶绿体的次生荧光主要是叶绿体的次生荧光主要是吖啶橙堆积在其表面吖啶橙堆积在其表面所致。所致。注意：吖啶橙注意：吖啶

26、橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光。的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光。 Molecular Formula: C17H20ClN3Molecular Weight: 301.82Absorption and fluorescence emission spectra of acridine orange bound to DNA实验步骤实验步骤 1.1.选取新鲜的嫩菠菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小选取新鲜的嫩菠菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称碎块，称3g3g放于玻璃研钵中，加入放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCl10ml0

27、.35mol/LNaCl溶液，匀浆溶液，匀浆3 3 5min5min。 2.2.匀浆液用匀浆液用1-21-2层尼龙布过滤于层尼龙布过滤于50ml50ml烧杯中。烧杯中。 3.3.将滤液平分到将滤液平分到2 2个离心管中，天平配平，个离心管中，天平配平，1000r/min1000r/min下离心下离心2min2min。弃。弃去沉淀。去沉淀。 4.4.将上清液在将上清液在3000r/min3000r/min下离心下离心5min5min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。弃去上清，沉淀即为叶绿体。 5.5.将沉淀用将沉淀用0.35mol/LNaCl0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：溶液悬浮

28、，做两张临时装片： 取一滴叶取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察绿体悬液滴于载片上，加盖片观察； 取一滴叶绿体悬液滴于载片上，取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加再滴加1 1滴滴0.01%0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察吖啶橙荧光染料，加盖片观察： 在普通光镜下观察；在普通光镜下观察；在荧光显微镜下观察在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察，找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激察，找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光作光源，用暗视野观察。发光作光源，用暗视野观察。 实验结果实验结果1

29、.1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。粒，即基粒。2.2.荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体自发荧光为火红色体自发荧光为火红色，间接荧光为桔红色。间接荧光为桔红色。问题：问题：叶绿体发出叶绿体发出的自发荧光和间接荧的自发荧光和间接荧光的由来与作用机理光的由来与作用机理有何不同？有何不同？实验结果实验结果图：叶绿体自发荧光为火红色图：叶绿体自发荧光为火红色实验报告记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，并分析结果，解释叶绿叶绿体发出的自发荧光和体发出的自发荧光和次生荧光的荧光的来由来由与与作作用机理用机理有何不同有何不同？1.分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？么？2.普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？3、什么叫离心力和转速，两者之间的关系如何？、什么叫离心力和转速，两者之间的关系如何？4、什么叫沉降系数，其单位用什么表示，如何定义？、什么叫沉降系数，其单位用什么表示，如何定义？思考题思考题