园艺植物基因的分离与克隆课件.pptx

1、第八章第八章 园艺植物基因的分离与克隆园艺植物基因的分离与克隆第一节第一节 文库筛选法文库筛选法第二节第二节 图位克隆技术图位克隆技术 第三节第三节 转座子标签法转座子标签法第四节第四节 基因差异表达技术基因差异表达技术 第五节第五节 同源序列法同源序列法第六节第六节 基因芯片技术基因芯片技术 第一节 文库筛选法一、园艺植物基因组文库的构建一、园艺植物基因组文库的构建二、园艺植物二、园艺植物cDNA文库的构建文库的构建三、目的基因的筛选三、目的基因的筛选 一、一、园艺植物基因组文库的构建园艺植物基因组文库的构建 基因文库的定义基因文库的定义l 一组一组DNA或或cDNA序列克隆的集合体。序列克

2、隆的集合体。 基因文库的类型基因文库的类型l基因组文库：来自园艺植物基因组全部基因组文库：来自园艺植物基因组全部DNA片段组成片段组成的基因文库，反映基因组的全部遗传信息。的基因文库，反映基因组的全部遗传信息。lcDNA文库：将某一特定组织表达的文库：将某一特定组织表达的mRNA反转录成反转录成cDNA组成的基因文库，每个克隆只含组成的基因文库，每个克隆只含1种种mRNA信息，信息，足够数目克隆则包含细胞全部足够数目克隆则包含细胞全部mRNA信息。信息。l cDNA便于克隆和大量扩增，不像基因组便于克隆和大量扩增，不像基因组DNA含有含有内含子很难表达。内含子很难表达。 一、一、园艺植物基因组

3、文库的构建园艺植物基因组文库的构建构建的植物基因组文库需满足的条件构建的植物基因组文库需满足的条件l 文库能够覆盖整个基因组。文库能够覆盖整个基因组。l 插入的插入的DNA片断比较大。片断比较大。l 文库易于保存且较稳定。文库易于保存且较稳定。基因组文库构建流程基因组文库构建流程示意图示意图 一、一、园艺植物基因组文库的构建园艺植物基因组文库的构建1.载体的制备载体的制备1.1完整的基因组文库所需要筛选的重组子数目完整的基因组文库所需要筛选的重组子数目l Nln(1-P)/ln(1-f) 。lN，重组子的数量；，重组子的数量；P，所要求的概率；，所要求的概率；f，某一插入片段，某一插入片段与相

4、应生物基因组大小的比值。与相应生物基因组大小的比值。l 要以要以0.99的概率获得番茄基因组（的概率获得番茄基因组（9.5108bp）20kb的插入片段，所需要筛选的重组子数目为：的插入片段，所需要筛选的重组子数目为：lNln(1-0.99)/ln1-(2104/9.5108)=2.2105 1.2载体的选择：载体的选择： a）质粒载体可承载）质粒载体可承载15kb DNA左右片段左右片段 (有效的范围为有效的范围为10kb) b） 载体可承载载体可承载25kb DNA左右片段左右片段(有效的范围为有效的范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载载体可承载45kb DNA左右片段左右片段

5、(有效的范围为有效的范围为40 kb) 1.31.3载体制备载体制备 要求：纯度高、去磷酸效果好。要求：纯度高、去磷酸效果好。 去磷酸化是为了提高载体和目标片断的连接效率。去磷酸化是为了提高载体和目标片断的连接效率。 纯度如果纯度如果不高不高则会在重组克隆中含有大量的细菌基则会在重组克隆中含有大量的细菌基因组因组DNA，影响文库的质量。，影响文库的质量。一、园艺植物基因组文库的构建一、园艺植物基因组文库的构建要求：一般提取的要求：一般提取的DNA相对分子量至少应该是文库相对分子量至少应该是文库最终平均插入片断长度的最终平均插入片断长度的3-5倍。倍。如插入片断达到如插入片断达到100kb以上，

6、则要求提取的基因组以上，则要求提取的基因组DNA分子量要达到分子量要达到500kb以上。以上。实践证明：提取的基因组实践证明：提取的基因组DNA分子量越大，得到的分子量越大，得到的重组克隆的插入片断越大。重组克隆的插入片断越大。2.大片段基因组大片段基因组DNA的制备的制备基因组DNA的不完全酶切2.1根据实验需要根据实验需要选择合适的限制性内切酶选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/40962.2分离目的酶切片段大小的确定分离目的酶切片段大小的确定 a

7、) 克隆单个基因：克隆单个基因：20kb2.3DNA不完全酶切条件不完全酶切条件的确定的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量固定酶切时间，改变限制酶的用量DNA的不完全酶切相同时间相同时间不同量不同量3.大片段DNA与克隆载体连接3.1酶切片段的分离与纯化）低熔点琼脂糖回收目的片段）试剂盒回收目的片段10 kb3.2酶切片段与克隆载体连接连接体系中的四种连接方式连接体系中的四种连接方式：载体自连、载体和基因组：载体自连、载体和基因组DNA片断的连接、基因组片断的连接、基因组DNA片断的自连和基因组片断之间片断的自连和基因组片

8、断之间的连接。的连接。只有只有基因组基因组DNA和载体之间的连接和载体之间的连接才是所需要的。如何提才是所需要的。如何提高它们之间的连接效率是连接反应的关键。高它们之间的连接效率是连接反应的关键。可以通过调整载体与基因组可以通过调整载体与基因组DNA的比例来达到较好的效果。的比例来达到较好的效果。一般比例为一般比例为1:51:15. 基因组基因组DNA片段片段3凹端的不完全补平的策略凹端的不完全补平的策略-GATC-CTAG- GATC-CTAG -Sau3AI-GA GATC-CTAG AG-KlenowdATP /dGTP-CTCGAG-GAGCTC-XhoIKlenowdCTP /dTT

9、P-CTC TCGAG-GAGCT CTC-互补GEM-11基因组DNAVector 4.载体的遗传转化载体的遗传转化l 电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段。电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段。l 插入片段越大，转化效率越低。插入片段越大，转化效率越低。 5.克隆的挑取、验证克隆的挑取、验证l 从文库中随机挑选一定量的克隆，摇菌，提取质粒从文库中随机挑选一定量的克隆，摇菌，提取质粒DNA，酶切后，脉冲电泳检查插入片段的大小，并，酶切后，脉冲电泳检查插入片段的大小，并根据数目计算空载率。根据数目计算空载率。l 细胞器细胞器DNA的污染会降低文库的实际容载量，一般的污染会降低文库的实际

10、容载量，一般用线粒体和叶绿体的探针对文库进行检测。用线粒体和叶绿体的探针对文库进行检测。6.文库的扩增、分装及保存 1) 影印滤膜保存法影印滤膜保存法2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长混合的细菌生长数代数代后，其培养物于后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为储存（加终浓度为25%的甘油）。的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。中某些特定的序列过多或过少。3) 保存单个克隆

11、子于含有甘油的培养基中保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为度后，加入终浓度为25%的甘油，于的甘油，于-70 oC或或-25 oC下保存。下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大 真核生物真核生物基因组基因组DNA十分庞大十分庞大，其复杂程度是，其复杂程度是mRNA的的100倍左右，而且倍左右，而且含有大量的重复序列含有大量的重复序列。 采用电泳分离和杂采用电泳分离和杂交的方法，都交的方法

12、，都难以直接分离到目的基因难以直接分离到目的基因。这是从染色体。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有高等生物一般具有105种种左右不同的基因，但在一定时间左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都只有阶段的单个细胞或个体中，都只有15%左右的基因得以表达左右的基因得以表达，产生约产生约15000种不同的种不同的mRNA分子。可见，由分子。可见，由mRNA出发的出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。二、园艺植物二、园艺植物cDNAcD

13、NA文库的构建文库的构建 二、园艺植物二、园艺植物cDNAcDNA文库的构建文库的构建 （一）普通（一）普通cDNA文库的构建文库的构建1. 纯化纯化mRNA样品的制备样品的制备l 选择特定发育阶段的特定组织为分离选择特定发育阶段的特定组织为分离mRNA的材料。的材料。l mRNA的纯化的纯化:利用利用mRNA的的3末端的末端的poly (A)尾巴与尾巴与oligo (dT)互补杂交，使互补杂交，使mRNA固定在固相介质上，再固定在固相介质上，再将将mRNA洗脱下来，制备出纯化的洗脱下来，制备出纯化的mRNA样品。样品。l mRNA样品完整性的检测：根据样品完整性的检测：根据28S和和18S

14、rRNA电泳电泳条带的亮度判断条带的亮度判断RNA的完整性，从而间接地判断的完整性，从而间接地判断mRNA的完整性。的完整性。l如果如果28S rRNA条带的亮度是条带的亮度是18S 的两倍，的两倍，RNA样品完整；样品完整；l如果两条带的亮度反过来，说明如果两条带的亮度反过来，说明RNA样品部分降解；样品部分降解；l如果无清晰的条带，说明如果无清晰的条带，说明RNA样品已经严重降解。样品已经严重降解。 2.cDNA第一链的合成第一链的合成 l关键是获得大量完整的关键是获得大量完整的cDNA拷贝。拷贝。l影响因素：模板影响因素：模板mRNA的质量、反转录酶、引物。的质量、反转录酶、引物。l反转

15、录酶：禽源反转录酶：禽源 (AMV)和鼠源反转录酶和鼠源反转录酶(M-MuLV)。l AMV：除具有：除具有DNA聚合酶活性外，还有很强的聚合酶活性外，还有很强的RNase H酶活性。酶活性。lM-MuLV ：RNase H活性比活性比AMV低，但反转录效率比低，但反转录效率比AMV低。低。lSuperscript反转录酶：除去了反转录酶：除去了MMLV的的RNase H活性，更能保证活性，更能保证cDNA第一链的全长和高产。第一链的全长和高产。l引物常用引物常用oligo (dT)和随机六聚体核苷酸。和随机六聚体核苷酸。 mRNAc cDNA第一链的合成第一链的合成 5ppp5G G AAA

16、AAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一链第一链引引物物退退火火逆转录酶逆转录酶dNTPs3.1自身引导法合成自身引导法合成cDNA第二链的技术流程第二链的技术流程 3.双链双链cDNA的合成的合成 3.2置换合成法置换合成法l利用利用RNase H将杂交双链中的将杂交双链中的mRNA降解，形成多段仍与降解，形成多段仍与cDNA第一链保持杂交的第一链保持杂交的RNA片段。片段。l利用这些利用这些RNA片段作为引物，引导

17、合成第二链片段作为引物，引导合成第二链cDNA。l随着合成产物的延伸，除随着合成产物的延伸，除5末端的末端的RNA引物外，所有作为引物引物外，所有作为引物的的RNA片段均被新合成的互补链所置换。片段均被新合成的互补链所置换。l通过通过DNA连接酶作用，将各段互补链连接成完整连接酶作用，将各段互补链连接成完整DNA链。链。l除去残存的除去残存的5末端末端RNA片段，并用片段，并用T4 DNA聚合酶削平聚合酶削平3端突端突出的单链出的单链cDNA，得到一个双链形式的，得到一个双链形式的cDNA片段。片段。l该方法直接利用第一链反应产物，避免了中间处理和纯化过程该方法直接利用第一链反应产物，避免了中

18、间处理和纯化过程造成的造成的cDNA损失，是目前合成损失，是目前合成cDNA第二链的常用方法。第二链的常用方法。置换合成法合成置换合成法合成cDNA第二链的技术流程第二链的技术流程 3.3同聚物引导法同聚物引导法 l在第一链的在第一链的3端用末端转移酶加上一段同聚体端用末端转移酶加上一段同聚体dG。l以以oligo (dC)为引物合成第二链。为引物合成第二链。l该法最大的缺点是获得的该法最大的缺点是获得的cDNA 5端上游有一段端上游有一段dG:dC残基，可能会抑制表达过程中残基，可能会抑制表达过程中DNA的转录。的转录。但该法在最佳条件下可高效克隆但该法在最佳条件下可高效克隆mRNA的的5端

19、序列。端序列。c cDNA第二链的合成第二链的合成 dCTPTdT引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火退火KlenowdNTPs4. 双链双链cDNA的克隆的克隆 cDNA的修饰的修饰 l为了提高双链为了提高双链

20、cDNA片段与载体的连接效率，需要对片段与载体的连接效率，需要对cDNA进行修饰，即给平端的双链进行修饰，即给平端的双链cDNA片段添加衔接头。片段添加衔接头。l所谓衔接头是人工合成的含有限制酶酶切位点的短双链所谓衔接头是人工合成的含有限制酶酶切位点的短双链DNA片段，或者一端为限制酶粘性末端的双链片段，或者一端为限制酶粘性末端的双链DNA片段。片段。l用前一种衔接头连接后，为了避免限制酶对用前一种衔接头连接后，为了避免限制酶对cDNA片段内部片段内部可能出现的酶切位点的切割，在添加衔接头之前，文库可能出现的酶切位点的切割，在添加衔接头之前，文库cDNA需经甲基化酶处理。需经甲基化酶处理。l添

21、加后一类型的衔接头时，不必对文库添加后一类型的衔接头时，不必对文库cDNA进行修饰。进行修饰。合成接头和衔接头合成接头和衔接头cDNA合成接头合成接头( (含酶切位点含酶切位点) )酶切酶切NotI, SalI与载体连接与载体连接Optional: methylation 接头中含稀有位点，接头中含稀有位点，如如NotI, SalI(100kb一次一次)先甲基化先甲基化ds cDNA，再，再连接接头连接接头4. 双链双链cDNA的克隆的克隆 cDNA的克隆的克隆 l将制备的将制备的cDNA成功克隆到载体中去的关键问题是成功克隆到载体中去的关键问题是cDNA和和载体的比例。载体的比例。l必须寻找

22、一个适当的比例以避免单个重组体中含有多个串必须寻找一个适当的比例以避免单个重组体中含有多个串联联cDNA分子或产生过高的非重组背景。分子或产生过高的非重组背景。l为提高连接反应效率，可在连接混合物中加适量为提高连接反应效率，可在连接混合物中加适量PEG 8000。l建成的建成的cDNA文库一般应进行效价测定并扩增，以利多次筛文库一般应进行效价测定并扩增，以利多次筛选并长期保存。选并长期保存。cDNA文库构建流程示意图文库构建流程示意图 5.普通普通cDNA文库存在的主要不足文库存在的主要不足 l 低丰度表达序列在文库中出现的几率很低，要想得低丰度表达序列在文库中出现的几率很低，要想得到低丰度表

23、达基因，至少要筛选到低丰度表达基因，至少要筛选106个克隆。个克隆。l 构建普通构建普通cDNA文库所需的文库所需的mRNA量比较大，达到数量比较大，达到数微克。微克。l 筛选普通筛选普通 cDNA文库的工作复杂，需要很长时间，文库的工作复杂，需要很长时间，限制了基因克隆的速度。限制了基因克隆的速度。二、园艺植物二、园艺植物cDNA文库的构建文库的构建 （二）新型（二）新型cDNA文库的构建文库的构建1. PCR介导的介导的cDNA文库文库 l 原理：以原理：以cDNA第一链为模板，设计一组引物，通过第一链为模板，设计一组引物，通过PCR扩增获得多拷贝双链扩增获得多拷贝双链cDNA。l 优点：

24、增加低丰度优点：增加低丰度mRNA的克隆机会；利用仅有的的克隆机会；利用仅有的几个细胞或微量的几个细胞或微量的mRNA建立较大的建立较大的cDNA文库。文库。l 缺点：缺点：PCR合成的片段一般较短，大片段的全长扩合成的片段一般较短，大片段的全长扩增困难；扩增过程中错误掺入率甚高；由于增困难；扩增过程中错误掺入率甚高；由于PCR对对短片段的扩增效率高于长片段，故短片段的扩增效率高于长片段，故mRNA的原始丰的原始丰度难以在文库中体现。度难以在文库中体现。l 应用：适合于克隆来源困难的组织或细胞的基因。应用：适合于克隆来源困难的组织或细胞的基因。（二）新型（二）新型cDNA文库的构建文库的构建2

25、. 标准化标准化cDNA文库文库 l 定义：某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含定义：某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且含量相等的其中，且含量相等的cDNA文库。文库。l 优点：优点：l增加了克隆丰度极低的增加了克隆丰度极低的mRNA的机会。的机会。l能发现普通能发现普通cDNA探针所不能发现的稀有转录区。探针所不能发现的稀有转录区。l能估计大多数基因的表达水平，并发现组织特异性基因。能估计大多数基因的表达水平，并发现组织特异性基因。（二）新型（二）新型cDNA文库的构建文库的构建3. 染色体或区域特异性染色体或区域特异性cDNA文库文库 l 用某一染色体或基因组区用某一染色体或

26、基因组区DNA与合成的与合成的cDNA池或池或已构建的已构建的cDNA文库杂交，将捕获的文库杂交，将捕获的cDNA进行进行PCR扩增，便可构建染色体或区域特异性扩增，便可构建染色体或区域特异性cDNA文库。文库。l 其中的其中的cDNA或定位于该染色体上或与之有同源性。或定位于该染色体上或与之有同源性。l 染色体显微切割技术的发展使得构建的文库更狭窄，染色体显微切割技术的发展使得构建的文库更狭窄，更具特异性。更具特异性。（二）新型（二）新型cDNA文库的构建文库的构建4. 消减消减cDNA文库文库l 又称差示文库，常用于克隆不同组织或同一组织在又称差示文库，常用于克隆不同组织或同一组织在不同的

27、生理状态下表达有差异的基因。不同的生理状态下表达有差异的基因。l 在一定条件下用过量不含目的基因的驱动方在一定条件下用过量不含目的基因的驱动方(driver)与含有目的基因的试验方与含有目的基因的试验方(tester)进行杂交，选择性进行杂交，选择性地去除相同基因杂交形成的复合物，将含有目的基地去除相同基因杂交形成的复合物，将含有目的基因的未杂交部分收集后构建相应的文库。因的未杂交部分收集后构建相应的文库。l 由于消减由于消减cDNA文库的富集作用，使所需筛选的克隆文库的富集作用，使所需筛选的克隆数减少几十到上百倍。数减少几十到上百倍。基因组基因组DNA文库文库cDNA文库文库基因组基因组DN

28、A文库与文库与cDNA文库的比较文库的比较三、目的基因的筛选三、目的基因的筛选 1. 根据目的基因的核苷酸序列筛选根据目的基因的核苷酸序列筛选 l 根据基因序列设计引物，以基因组根据基因序列设计引物，以基因组DNA或或mRNA反反转录的转录的cDNA为模板进行为模板进行PCR扩增。如果得到的只是扩增。如果得到的只是基因部分序列，可以将其克隆至载体，作为探针筛基因部分序列，可以将其克隆至载体，作为探针筛选选cDNA文库和基因组文库获得全长基因。文库和基因组文库获得全长基因。l 用探针直接筛选库，若能得到其它植物已分离的相用探针直接筛选库，若能得到其它植物已分离的相关基因，则可以直接用作探针筛选关

29、基因，则可以直接用作探针筛选cDNA文库和基因文库和基因组文库，获得研究植物的目的基因。组文库，获得研究植物的目的基因。2. 根据目的基因的表达特性筛选根据目的基因的表达特性筛选 l 如果已知基因表达产物（蛋白质）的氨基酸序列，如果已知基因表达产物（蛋白质）的氨基酸序列，就可以反推出原来基因的核苷酸序列。就可以反推出原来基因的核苷酸序列。l 从从N端对端对10多个连续的氨基酸进行序列测定，选择多个连续的氨基酸进行序列测定，选择连续连续6个以上简并程度最低的氨基酸，按各种可能的个以上简并程度最低的氨基酸，按各种可能的序列结构合成寡核苷酸探针库，从序列结构合成寡核苷酸探针库，从cDNA文库和基因文

30、库和基因组文库中筛选全长的基因。组文库中筛选全长的基因。l 缺点：在实验中得到纯度高、数量足够的目的基因缺点：在实验中得到纯度高、数量足够的目的基因表达产物（蛋白质）是很困难的，蛋白质测序也花表达产物（蛋白质）是很困难的，蛋白质测序也花费较高，难度较大。费较高，难度较大。3. PCR法筛选基因文库法筛选基因文库 l 将基因文库分装将基因文库分装96孔培养板。孔培养板。l 培养一段时间后，分别从同一行或同一列孔中吸取培养一段时间后，分别从同一行或同一列孔中吸取少量培养物合并。少量培养物合并。l 以此混合物为模板进行以此混合物为模板进行PCR扩增，根据凝胶电泳的扩增，根据凝胶电泳的结果判定相应行或

31、列混合孔中是否含有阳性克隆。结果判定相应行或列混合孔中是否含有阳性克隆。l 对含有阳性克隆的行或列孔中的培养物再次分装，对含有阳性克隆的行或列孔中的培养物再次分装，经培养后进行第二轮经培养后进行第二轮PCR扩增。扩增。l 如此反复操作，直至获得阳性克隆。如此反复操作，直至获得阳性克隆。第二节第二节 图位克隆技术图位克隆技术一、分离基因的程序一、分离基因的程序 二、二、优缺点优缺点一、分离基因的程序一、分离基因的程序 （一）图位克隆技术的定义及原理（一）图位克隆技术的定义及原理l 定义：根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆定义：根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法。的一种方法。

32、l 原理：首先找到一个与目标基因相连的原理：首先找到一个与目标基因相连的DNA分子标分子标记，然后通过染色体步移技术克隆分离出目标基因。记，然后通过染色体步移技术克隆分离出目标基因。l当基因与标记之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入当基因与标记之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小时，就可直接筛选到含有目标基因的克隆，这种方片段大小时，就可直接筛选到含有目标基因的克隆，这种方法称为染色体登陆法称为染色体登陆(chromosome landing)。 （二）分离基因的程序（二）分离基因的程序1. 目的基因的初步定位目的基因的初步定位l 利用分子遗传图谱确定与目的基因连锁的分子标记。

33、利用分子遗传图谱确定与目的基因连锁的分子标记。2. 目的基因区域的物理作图目的基因区域的物理作图l 将分子标记之间的遗传距离（将分子标记之间的遗传距离（cM）转化为物理距离）转化为物理距离（碱基数），构成该基因区域的物理图谱。（碱基数），构成该基因区域的物理图谱。3. 构建并筛选含有大插入片段的基因组文库构建并筛选含有大插入片段的基因组文库l 用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选大片段基因用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选大片段基因组文库，获阳性克隆。组文库，获阳性克隆。（二）分离基因的程序（二）分离基因的程序4. 构建目的基因区域跨叠克隆群构建目的基因区域跨叠克隆群l 以阳性克隆的末端作为

34、探针筛选基因组文库，获得含以阳性克隆的末端作为探针筛选基因组文库，获得含有目标基因两侧分子标记的大片段跨叠群。有目标基因两侧分子标记的大片段跨叠群。5. 目的基因的精细定位和染色体登陆目的基因的精细定位和染色体登陆l 以目标基因两侧的分子标记为探针，通过染色体登陆以目标基因两侧的分子标记为探针，通过染色体登陆获得含目标基因的阳性克隆。获得含目标基因的阳性克隆。6. 外显子的分离和鉴定外显子的分离和鉴定l 利用筛选利用筛选cDNA文库、外显子捕捉等技术获得候选基文库、外显子捕捉等技术获得候选基因，通过功能互补实验确定目标基因。因，通过功能互补实验确定目标基因。二、优缺点二、优缺点 l主要应用于基

35、因组较小、分子标记连锁图密度较高和转主要应用于基因组较小、分子标记连锁图密度较高和转化系统比较稳定成熟的植物。化系统比较稳定成熟的植物。l对于基因组较大、重复序列较多的园艺植物，图位克隆对于基因组较大、重复序列较多的园艺植物，图位克隆法要步移大量的法要步移大量的DNA片段，投资大，效率低；而且片段，投资大，效率低；而且DNA大片段插入文库含有许多嵌套克隆或克隆后的重排大片段插入文库含有许多嵌套克隆或克隆后的重排现象等原因，使得染色体步移十分困难。现象等原因，使得染色体步移十分困难。l对于这些植物，可以通过构建高密度的分子遗传图谱和寻找物对于这些植物，可以通过构建高密度的分子遗传图谱和寻找物理距

36、离目的基因很近的分子标记，使得染色体步移的距离大大理距离目的基因很近的分子标记，使得染色体步移的距离大大缩小。缩小。第三节第三节 转座子标签法转座子标签法一、转座子的分类一、转座子的分类二、分离基因的程序二、分离基因的程序三、优缺点三、优缺点四、四、T-DNA标签法标签法 一、转座子的分类一、转座子的分类 （一）转座子的定义与功能（一）转座子的定义与功能1. 定义定义l 染色体上一段可以移动的染色体上一段可以移动的DNA序列，可以从一个基序列，可以从一个基因座位转移到另一个基因座位。因座位转移到另一个基因座位。2. 功能功能l 当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时，就当转座子插入到某个功

37、能基因内部或邻近位点时，就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型；而当转会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型；而当转座子切离时，又使目的基因恢复活性。座子切离时，又使目的基因恢复活性。（二）转座子的分类（二）转座子的分类1. DNA转座子转座子l 通过通过DNA复制和直接切离两种方式获得可转移片段，复制和直接切离两种方式获得可转移片段，重新插入基因组重新插入基因组DNA中。中。2. 反转录转座子反转录转座子 l 由由RNA介导的转座子，即作为介导的转座子，即作为DNA的转座子首先被的转座子首先被转录为转录为RNA，再借助反转录酶反转录合成，再借助反转录酶反转录合成DNA，插，插入到新的染色体

38、位点来实现转座过程的。入到新的染色体位点来实现转座过程的。二、分离基因的程序二、分离基因的程序 l 采取农杆菌介导等适当的转化方法把转座子导入目标采取农杆菌介导等适当的转化方法把转座子导入目标植物，设法将转座子插入到目标基因内部或邻近位点，植物，设法将转座子插入到目标基因内部或邻近位点，引起表型突变。引起表型突变。l 通过表型筛选获得纯合突变株。通过表型筛选获得纯合突变株。l 构建纯合突变株的核基因组文库。构建纯合突变株的核基因组文库。l 以转座子片段作为探针，从该基因组文库中筛选含转以转座子片段作为探针，从该基因组文库中筛选含转座子片段的克隆。座子片段的克隆。l 以该克隆作为探针，筛选另一正

39、常植株的核基因组文以该克隆作为探针，筛选另一正常植株的核基因组文库，获得完整的正常目的基因。库，获得完整的正常目的基因。转座子标签法克隆基因示意图转座子标签法克隆基因示意图 三三、优缺点优缺点l 优点：利用转座子标签法可在不了解基因产物的生化优点：利用转座子标签法可在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下分离植物基因。性质和表达模式的情况下分离植物基因。l 局限性局限性l该技术的前提条件是要筛选出转座子插入的突变体。在实际该技术的前提条件是要筛选出转座子插入的突变体。在实际操作中，由于转座频率往往很低，因此需要筛选的突变体群操作中，由于转座频率往往很低，因此需要筛选的突变体群体较大。体较大

40、。l对于那些须在特定环境或特定发育阶段才有突变表型的基因，对于那些须在特定环境或特定发育阶段才有突变表型的基因，往往由于看不到明显的突变表型而被忽略。往往由于看不到明显的突变表型而被忽略。l由于基因的功能补偿等机制的作用，即使有些基因产生了插由于基因的功能补偿等机制的作用，即使有些基因产生了插入突变，也可能看不到突变表型，因而不能运用该方法。入突变，也可能看不到突变表型，因而不能运用该方法。四四、 T-DNA标签法标签法l 原理：原理：T-DNA能够从农杆菌中转移并稳定地整合到能够从农杆菌中转移并稳定地整合到植物宿主的基因组中，从而使整合位置上的基因失活植物宿主的基因组中，从而使整合位置上的基

41、因失活或产生突变，通过或产生突变，通过T-DNA上的标记基因上的标记基因(如如GUS等基等基因因)就可检测突变位置，得到与就可检测突变位置，得到与T-DNA相连的相连的DNA片片段，以此制备探针筛选野生型基因文库，就可得到与段，以此制备探针筛选野生型基因文库，就可得到与突变相应的完整基因。突变相应的完整基因。l 缺点缺点l由于由于T-DNA的可移动性，不易获得较稳定的突变遗传系。的可移动性，不易获得较稳定的突变遗传系。l由于高等植物基因组中大量的重复序列存在，也降低了获得由于高等植物基因组中大量的重复序列存在，也降低了获得目标突变体的效率，实验周期较长。目标突变体的效率，实验周期较长。第四节第

42、四节 基因差异表达技术基因差异表达技术 一、一、mRNA差异显示技术差异显示技术二、二、抑制性消减杂交技术抑制性消减杂交技术三、三、代表性差异分析法代表性差异分析法四、基因表达系列分析四、基因表达系列分析五、五、cDNA-AFLP技术技术 一、一、mRNA差异显示技术差异显示技术 1. 原理原理l 根据大多数真核细胞根据大多数真核细胞mRNA的的3端具有端具有Poly(A)结构，结构，利用含利用含Oligo (dT)的寡聚核苷酸作为引物，将总的寡聚核苷酸作为引物，将总mRNA反转录为反转录为cDNA，然后通过，然后通过PCR技术和变性聚技术和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异丙烯酰胺凝胶电泳分离差

43、异cDNA 片段，从而筛选出片段，从而筛选出目的基因。目的基因。2. 基本步骤基本步骤l 从不同植物或组织中提取总从不同植物或组织中提取总mRNA。l 用用Oligo(dT)12MN为引物为引物(其中，其中，MG/C/A，NG/C/T/A)，在反转录酶的作用下，将，在反转录酶的作用下，将mRNA反转录成反转录成cDNA。l 用与反转录相同的锚定引物和由用与反转录相同的锚定引物和由10 个碱基组成的随个碱基组成的随机引物对生成的机引物对生成的cDNA进行进行PCR扩增。扩增。l PCR扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在相邻泳扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在相邻泳道上分析，找到差异表达的道上

44、分析，找到差异表达的cDNA条带。条带。l 回收差异表达的条带，将其作为探针进行回收差异表达的条带，将其作为探针进行Northern杂杂交或筛选交或筛选cDNA文库，获得差异表达的基因全长。文库，获得差异表达的基因全长。mRNA差异显示技术示意图差异显示技术示意图 5-AAAAAAAAAAAA mRNA NNTTTTTTTTTTTTanchor primer1st strand cDNANNTTTTTTTTTTTTNNNNNNN10-13bp arbitrary primerPCR (36-38C)anchor + arbitrary primersseparation onpolyacryl

45、amide gelABDifferential DisplayDifferential HybridizationcDNAlibrarylow density(1,000/150mm)Replica plaque liftingmRNA (sample A)mRNA (sample B)labeled probelabeled probehybridization3. 优缺点优缺点l 优点优点l在基因序列未知的情况下，直接用来鉴定和克隆差异表达基在基因序列未知的情况下，直接用来鉴定和克隆差异表达基因，具有简便、快速、因，具有简便、快速、RNA用量少、效率高等优点。用量少、效率高等优点。l主要用

46、于比较两种以上特定生理状态或不同发育阶段的主要用于比较两种以上特定生理状态或不同发育阶段的mRNA样品间基因表达的差异。样品间基因表达的差异。l 缺点缺点l假阳性特别高，可达假阳性特别高，可达70%，增加了后续工作的难度。，增加了后续工作的难度。l由于由于PCR 的敏感性，的敏感性，mRNA 差异显示技术重复性较差。差异显示技术重复性较差。l扩增片段较小扩增片段较小(110500 bp)，不能代表差异表达的基因。，不能代表差异表达的基因。l只能扩增靠近只能扩增靠近Poly（A）mRNA 3端不大于端不大于600 bp 的区域。的区域。l对高拷贝对高拷贝mRNA有较强的倾向性，不能用于低拷贝的有

47、较强的倾向性，不能用于低拷贝的mRNA。二、抑制性消减杂交技术二、抑制性消减杂交技术 1. 原理原理l 以抑制以抑制PCR为基础的为基础的cDNA消减杂交。消减杂交。l 所谓抑制所谓抑制PCR是利用非目标基因片段两端的长方向是利用非目标基因片段两端的长方向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。片段的扩增。2. 基本步骤基本步骤l 提取含有目的基因的待测组织提取含有目的基因的待测组织(tester)和不含目的基因和不含目的基因的对照组织（的对照组织

48、（driver)的的mRNA，并反转录为，并反转录为cDNA。l 用限制性内切酶将两种不同的用限制性内切酶将两种不同的cDNA切割为小片段。切割为小片段。l 将将tester cDNA分为两份，分别连接不同的接头。分为两份，分别连接不同的接头。l 用过量的用过量的driver cDNA分别与这两种分别与这两种tester cDNA进行进行第一次消减杂交，会产生：单链第一次消减杂交，会产生：单链tester、双链、双链tester/tester、双链、双链tester/driver、单链、单链driver及双链及双链driver /driver。2. 基本步骤基本步骤l 混合两份杂交样品，并加入

49、新的变性混合两份杂交样品，并加入新的变性driver cDNA进进行第二次消减杂交，从而形成一种新的杂交组分，即行第二次消减杂交，从而形成一种新的杂交组分，即分别含有不同接头的双链分别含有不同接头的双链cDNA分子分子 （tester-adaptor 1/tester- adaptor 2）。）。l 补平变性后分子的粘性末端。补平变性后分子的粘性末端。l 以接头以接头 1和接头和接头 2序列为引物对其进行第一轮序列为引物对其进行第一轮PCR。l 用与接头内侧序列互补的另一对引物进行第二轮用与接头内侧序列互补的另一对引物进行第二轮PCR，富集差异表达的目的基因片段。富集差异表达的目的基因片段。l

50、 用第二轮用第二轮PCR产物构建相应的差减产物构建相应的差减cDNA文库，克隆文库，克隆差异表达基因。差异表达基因。抑制性消减杂交技术示意图抑制性消减杂交技术示意图 3. 优缺点优缺点l 优点优点l假阳性率大大降低，阳性检出率为假阳性率大大降低，阳性检出率为50%以上。以上。l目的序列富集程度较高，且丰度相对一致，确保了低丰度表目的序列富集程度较高，且丰度相对一致，确保了低丰度表达的达的cDNA有被检测的可能，极大地提高了检测效率；有被检测的可能，极大地提高了检测效率；l灵敏度很高，重复性强。灵敏度很高，重复性强。l一次一次SSH实验中可同时富集上百个差别表达的基因，远远胜实验中可同时富集上百