基因操作常规技术(ppt)课件.ppt

1、基因操作常规技术(ppt)（优选）基因操作常规技术4.1 核酸的分离与检测核酸的分离与检测 gDNA的分离的分离 质粒质粒DNA RNA的分离的分离 细胞破碎细胞破碎 去蛋白去蛋白 DNA沉淀沉淀4.1.1 gDNA的提取的提取 SDS法法 酚抽提法酚抽提法 CTAB法法CTAB法法 高盐高盐: 溶解溶解 低盐低盐: 沉淀沉淀蛋白蛋白、多糖分离多糖分离NaAc-70% alc如何保持如何保持CS-DNA的完整性的完整性? 物理降解物理降解 内源内源DNase pH74.1.2 质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化 拓扑学的差异拓扑学的差异 gDNA大大, 易解旋易解旋质粒小质粒小, ccc状态状

2、态proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs1. CsCl密度梯度超离心密度梯度超离心密度梯度密度梯度沉降沉降=扩散扩散浮力密度差浮力密度差样品样品+EB样品样品BD = 该位置上的该位置上的CsCl密度密度位置分布位置分布: 沉降速度沉降速度、 MW及离心时间及离心时间 Sol I; II; IIIcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA2. 碱变性法碱变性法 pH12: 变性程度变性程度 pH7: 复性速度复性速度 离心离心: 收集收集?3. 沸水浴法沸水浴法 加酶破壁加酶破壁 沸水浴沸水浴40 s 离心离心 Eth沉淀沉淀 4.1.3 RNA的提取的提取 原理原

3、理 酚酚- -异硫氰酸胍异硫氰酸胍防止防止RNA降解的措施降解的措施 DEPC处理处理 RNasin 专用无菌台专用无菌台 器皿器皿、手套手套、口罩口罩 低温操作低温操作4.1.4 核酸质量检测核酸质量检测 紫外光谱法紫外光谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 ssDNA=33 (A260 A310) 稀释稀释 dsDNA=50 (A260 A310) 稀释稀释 ssRNA=40 (A260 A310) 稀释稀释 荧光分析法荧光分析法 二苯胺显色二苯胺显色 分子筛分子筛; 电荷效应电荷效应 UVEB荧光荧光凝胶电泳技术凝胶电泳技术凝胶成像系统凝胶成像系统Rf、分辨力分辨力的影响因素的影响因素 大小大小,

4、 构型构型 gel浓度浓度 buffer凝胶浓度凝胶浓度 片段大小片段大小/kb 0.3 5 60 0.6 1 10 0.7 0.8 20 1.0 0.5 8 1.2 0.4 6 1.5 0.2 3 2.0 0.1 2缓冲液及其缓冲液及其pH TBE: 缓冲力大缓冲力大长长 : TAETBE短短: TAE分辨力低分辨力低如何防止如何防止pH和离子强度改变和离子强度改变? ?RNA的检测的检测 A260 变性胶变性胶28S4.5 kb18S2.1 kbPAGE 尿素尿素 buffer: 0.5 1 TBE同位素或荧光标记同位素或荧光标记测序测序、多态性分析多态性分析 40kb: Rf与分子大小无

5、关与分子大小无关 交替改变的电场交替改变的电场, ,线团线团束状束状脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 改变形状所需时间不同改变形状所需时间不同 胶孔中摩擦力不同胶孔中摩擦力不同A-+AB-+BB+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图A-+AB-+B垂直交变电场系统垂直交变电场系统场翻转系统场翻转系统箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统旋转胶系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+影响分辨率的因素影响分辨率的因素 脉冲时间脉冲时间( (0.1s-1000s): 长长脉冲脉冲, ,大片段大片段 电压电压: 场强场强,最最大片段范围大片段范围 电场夹角电场夹角: 110 120 温度温

6、度: : 4 4.2 分子杂交技术分子杂交技术 Southern blot Northern blot Western blot dot blot FISH 菌落原位杂交菌落原位杂交4.2.1 探针与探针标记探针与探针标记 寡核苷酸片段寡核苷酸片段ss or ds足够长度足够长度不含互补区不含互补区5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA( -32P-dATP)5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5

7、5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 DNase IDNA pol I1. 探针的标记探针的标记随机引物标记随机引物标记5末端标记末端标记5 HOOH 3 OH 5 T4-PNKMg2+ pppATP ( -32P-dATP)5 pp 5 3 HO3 HOOH 3 2. 标记物及其检测标记物及其检测标记物及性质标记物及性质 标记方法标记方法 杂交体检测法杂交体检测法地高辛地高辛: DIG RPL 酶标抗体酶标抗体- -底物显色底物显色生物素生物素: Bio-16-dUTP NT,TL,PCR 酶标亲合素显色酶标亲合

8、素显色荧光素荧光素: 罗丹明罗丹明,FITC 合成法合成法 荧光显微镜荧光显微镜放射性标记放射性标记非放射性非放射性地高辛系统标记地高辛系统标记dUTP-连接臂-甾醇半抗原DIG抗体抗体-显色酶交联复合物显色酶交联复合物生物素标记生物素标记GCTTGAGCAGTAACCTG显色酶显色酶Biotin Avidin 烷烃连接臂烷烃连接臂生色底物生色底物颜色产物颜色产物荧光素标记荧光素标记GCTTGAGCAGTAACCTG荧光素荧光素Biotin Avidin烷烃连接臂烷烃连接臂4.2.2 Southern杂交杂交 质粒鉴定质粒鉴定、基因位置基因位置、分子诊断分子诊断酶切和电泳法可以吗酶切和电泳法可

9、以吗? ?4.2.3 Northern杂交杂交 样品样品, 电泳电泳, 探针探针不宜碱变性不宜碱变性勿低盐勿低盐buffer洗膜洗膜胶中无胶中无EB4.2.4 Western杂交杂交 电泳电泳, 印迹印迹, 免疫学免疫学 主要步骤主要步骤SDS-PAGE, blot杂交杂交(AP或或HRP)Semi-dry transfer system斑点杂斑点杂交交4.2.5Allele-specific oligonucleotide (ASO) dot-blot hybridization can identify individuals with the sickle cell mutation.

10、The schematic dot-blot at top shows the result of probing with an ASO specific for the normal -globin allele (A-ASO). The results are positive (filled circle) for normal individuals and for heterozygotes but negative for sickle cell homozygotes (dashed, unfilled circle). The dot-blot at the bottom s

11、hows the result of probing with an ASO specific for the sickle cell -globin allele (S-ASO), and in this case the results are positive for the sickle cell homozygotes and heterozygotes but negative for normal individuals. The A- and S-ASO were designed to be 19 nucleotides long in this case chosen fr

12、om codons 3 to 9 of respectively the sense A and S globin gene sequences surrounding the sickle cell mutation site. The latter is a single nucleotide substitution (AT) at codon 6 in the -globin gene, resulting in a GAG (Glu)GTG (Val) substitution (see middle sequences). 制片制片 探针制备探针制备 杂交杂交 镜检镜检、拍照拍照4

13、.2.6 FISH杂交杂交基因检测新技术使膀胱癌确诊提前基因检测新技术使膀胱癌确诊提前 “FISH技术在膀胱癌检测中的临床应用研究技术在膀胱癌检测中的临床应用研究”, ,为期为期2年年, ,对对4809例患者开展了临床检测实验例患者开展了临床检测实验. .结果结果: :比临床常规检查比临床常规检查, ,膀胱癌确诊提前膀胱癌确诊提前3 6 m 杂交探针和检测试剂已实现国产化杂交探针和检测试剂已实现国产化,质量稳定可质量稳定可靠靠,价格比进口产品降低近七成价格比进口产品降低近七成4.2.7 菌落菌落(斑斑)原位杂交原位杂交 阳性重组子检测阳性重组子检测菌落菌落 ?文库文库菌斑菌斑 ?文库文库4.3

14、 PCR扩增扩增技术技术 链式反应链式反应 动物单拷贝动物单拷贝GSince its discovery in 1983 the polymerase chain reaction has revolutionized molecular biology. Today, new forms of PCR and the related techniques of cloning are finding new applications at the cutting edge of biomedicine. 4.3.1 基本原理基本原理 离体合成离体合成 几何级数几何级数 平台效应平台效应4.3

15、.2 反应体系反应体系 模板模板 引物引物 Taq 酶酶 dNTPs 缓冲液缓冲液DNA or mRNA模板纯度模板纯度数量数量引物的设计引物的设计 16 30 nt, GC含量含量 连续互补碱基连续互补碱基3 3?正确配对正确配对5?可被可被修饰修饰简并引物简并引物耐热的耐热的DNA pol Taq酶酶 Pfu酶酶3 5 校读校读高保真高保真缓冲液缓冲液 pH、离子强度离子强度Mg2+,酶活酶活Mg2+,非特异非特异引物退火引物退火4.3.2 基本过程基本过程 变性变性 退火退火 延伸延伸扩增精确性的影响因素扩增精确性的影响因素 引物引物: 1 mol/L dNTPs: 20200 mol/

16、L Mg+2: 0.52.5 mmol/L hot start4.3.3 PCR技术的改进技术的改进 nested PCR inverse PCR anchored PCR RT-PCR in situ PCR 实时定量实时定量PCR1. 巢式巢式PCR 嵌套引物嵌套引物外引物外引物内引物内引物2. 反向反向PCR X、Y未知序列未知序列酶酶R消化消化环化环化再酶切再酶切扩增扩增反向反向PCR的特点的特点 难选适当的限制酶难选适当的限制酶 扩增的长度有限扩增的长度有限 自身环化效率低自身环化效率低3. Anchored PCR锚定引物锚定引物A扩增扩增产物鉴定产物鉴定特点特点 扩增未知序列扩增

17、未知序列 无需酶切及连接无需酶切及连接 操作简单操作简单 特异性高特异性高4. RT-PCR5. 原位原位PCR 原位扩增原位扩增, 杂交杂交, 定量定量不需抽提模板不需抽提模板灵敏度高灵敏度高100 病毒检测病毒检测、肿瘤发生率肿瘤发生率 通过对通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测的实时监测,实现对起始模板定量分析的方法实现对起始模板定量分析的方法6. 实时荧光定量实时荧光定量PCR FRET技术技术; 荧光标记探针荧光标记探针 扩增扩增、杂交杂交、光谱光谱、实时检测实时检测 荧光信号积累荧光信号积累,起始模板量起始模板量荧光定量荧光定量PC

18、R的原理的原理起点定量与终点定量起点定量与终点定量起点起点天然天然重现性好重现性好终点终点加工加工误差大误差大荧光扩增曲线的三个阶段荧光扩增曲线的三个阶段背景信号阶段背景信号阶段指数扩增指数扩增平台期平台期几个参数的确定几个参数的确定临界点临界点循环数循环数(Ct)标准曲线标准曲线基线基线阈值阈值Ct值值 DNA 0阈值缺省阈值缺省: 3-15个个循环的荧光信号的标准偏差的循环的荧光信号的标准偏差的10倍倍Log浓度浓度与与循环循环数的关系数的关系 起始数越多起始数越多,Ct值越小值越小 标准曲线标准曲线样品样品Ct值值初始模板量初始模板量DNA产物的荧光标记产物的荧光标记 非特异性荧光标记非

19、特异性荧光标记SYBR Green I 特异性荧光标记特异性荧光标记TaqMan探针探针分子信标分子信标 SYBR Green法法 只有和只有和dsDNA结合后才发荧光结合后才发荧光 变性时变性时,DNA双链分开双链分开,无荧光无荧光 延伸结束阶段采集荧光信号延伸结束阶段采集荧光信号 与非特异的与非特异的dsDNA结合发光结合发光,必须必须在反应结束时做融解曲线分析在反应结束时做融解曲线分析SYBR Green融解曲线分析融解曲线分析PCR反应体系的建立及优化反应体系的建立及优化 染料染料: :太高抑制太高抑制Taq酶活性酶活性; ;太低太低, ,荧荧光信号太弱光信号太弱, ,不易检测不易检测

20、 引物引物: :扩增有杂带扩增有杂带, ,定量不准定量不准 Mg2+: :1.5mM, ,减少非特异性产物减少非特异性产物 T & T: :由酶和引物决定由酶和引物决定SYBR Green法优缺点法优缺点 对模板无选择性对模板无选择性 使用方便使用方便, ,无需探针无需探针 灵敏灵敏; ;便宜便宜 非特异性非特异性结合结合, ,产生假阳性产生假阳性 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高 5 -R; 3 荧光淬灭基团荧光淬灭基团(Q) 探针完整探针完整,R发射的荧光能量被发射的荧光能量被Q吸吸收收,无荧光无荧光; R与与Q分开分开,发荧光发荧光 Taq酶酶: 5 3 外切酶活性外切酶活性 T

21、aqMan法法TaqMan水解型杂交探针原理水解型杂交探针原理当一个荧光分子当一个荧光分子( (供体供体) )的荧光光谱与另一个荧光分子的荧光光谱与另一个荧光分子( (受体受体) )的激的激发光谱相重叠时发光谱相重叠时, ,供体荧光分子自身的荧光强度衰减供体荧光分子自身的荧光强度衰减, ,FRET荧光共振能量转移荧光共振能量转移扩增扩增1条条DNA释放释放1个荧光分子个荧光分子荧光信号的累积与荧光信号的累积与PCR产物同步产物同步TaqMan法法PCR反应的建立反应的建立 PP的设计的设计: 探针探针Tm为为70,30bp, 5非非G; 引引物物Tm为为60 反应参数反应参数: : 95 3

22、, 94 15s, 60 60s,40循环循环 PP优化优化: :获得最小获得最小Ct值值, ,最大信号最大信号/ /背景比值背景比值primer: : 50-900nM; probe: 50-250nMTaqMan法优缺点法优缺点 对目标序列的高特异性对目标序列的高特异性 引物设计相对简单引物设计相对简单 重复性比较好重复性比较好 只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标 委托公司标记委托公司标记,价格较高价格较高 分子信标分子信标 与扩增产物结合产生荧光与扩增产物结合产生荧光,信号的强弱信号的强弱靶序列的多少靶序列的多少发夹型荧光探针发夹型荧光探针 R与与Q接近接近, ,产生产生FRET

23、探针探针- -模板配对模板配对, ,构象改变构象改变 R与与Q分离分离荧光荧光荧光定量荧光定量PCR的特点的特点 实时检测实时检测 特异性强特异性强 定量精确定量精确 无需跑胶无需跑胶4.4 DNA测序测序 化学降解法化学降解法 末端终止法末端终止法 G反应反应: DMS使使G、A甲基化甲基化 G+A: 哌啶使哌啶使G断裂断裂 T+C: 肼使嘧啶环断开肼使嘧啶环断开,哌哌啶除去碱基啶除去碱基 C反应反应: 高盐下高盐下,仅仅C与肼反与肼反应应,C末端末端 1. Maxam-Gilbert化学降解法化学降解法 距标记末端距标记末端250nt 非酶促合成测序非酶促合成测序,无需引物无需引物 对合成

24、的寡核苷酸测序对合成的寡核苷酸测序 蛋白质与蛋白质与DNA的相互作用的相互作用特点特点2. Sanger酶学酶学法法基本步骤基本步骤 模板纯化模板纯化 测序反应测序反应模板模板,引物引物, Pol, dNTPs (dd)4个反应个反应4组产物组产物 PAGE自显影自显影X光片光片 上样电泳上样电泳 放射自显影放射自显影 测序测序 PCR引物引物 1条条 1对对合成合成 线性线性 指数指数底物底物 dNTP和和dd dNTP产物产物 系列长度片段系列长度片段 1条带条带CAGTtemplateprimerdATP,dNTPpolymeraseterminator3. DNA全自动测序全自动测序

25、同位素标记同位素标记 荧光标记荧光标记单色荧光单色荧光多色荧光多色荧光时间长时间长序列短序列短污染大污染大操作难操作难放射自显影胶图放射自显影胶图多色荧光标记多色荧光标记templateprimerdNTPpolymeraseterminatorCGTAABI Prism 3100-Avant遗传分析仪的多种应用遗传分析仪的多种应用基本步骤基本步骤 模板的纯化与定量模板的纯化与定量 测序反应测序反应PCR仪仪 产物的纯化与变性产物的纯化与变性 上样电泳上样电泳测序仪测序仪 结果分析结果分析Automated DNA sequencing with fluorescently labeled d

26、dNTP. (A) The chain termination reactions are carried out in a single tube, with each ddNTP labeled with a different fluorophore. In the automated sequencer, the bands in the electrophoresis gel move past a fluorescence detector, which identifies which ddNTP is present in each band. The information

27、is passed to the imaging system. (B) The printout from an automated sequencer. The sequence is represented by a series of peaks, one for each nucleotide position. In this example, a green peak is an A, blue is C, black is G, and red is T. 4. DNA测序技术进展测序技术进展传统传统测序技术的缺陷及新进展测序技术的缺陷及新进展 序列不可能太长序列不可能太长 费

28、时费力费时费力 准确度不高准确度不高 结构复杂序列结构复杂序列 杂交法杂交法 质谱法质谱法 DNA芯片法芯片法 单分子法单分子法4.5 DNA的定点诱变的定点诱变 盒式取代盒式取代切除切除; 合成合成; 转化转化 olig介导介导 PCR诱变诱变 olig片段片段 退火退火 合成合成 转化转化olig介导的诱变介导的诱变Oligonucleotide mismatch mutagenesis can create a desired point mutation at a unique predetermined site within a cloned DNA moleculePCR诱诱变变

29、4.6 DNA与蛋白质互作分析与蛋白质互作分析 Y2H system Y1H system gel retardation assays DNase I footprinting1. 酵母双杂交酵母双杂交(Y2H) GAL4 proteinBD与与UAS结合结合AD激活激活lac Z单独不起作用单独不起作用GAL1 UAS启动子启动子lac Z reporterGAL1 UAS启动子启动子lac Z reporterXGAL4BDGAL1 UAS启动子启动子 lac Z reporterYGAL4ADAB穿梭载体穿梭载体GAL4 菌菌 GAL1 UAS启动子启动子 lac Z reporter

30、XGAL4BDYGAL4AD转录转录CGAL1 UAS启动子启动子 lac Z reporterXGAL4BDYGAL4AD不转录不转录D 待测待测TF的的cDNA取代取代BD 激活报告基因表达激活报告基因表达2. 酵母单杂交酵母单杂交(Y1H)应用应用 检测蛋白间的相互作用检测蛋白间的相互作用 确定相互作用的结构域确定相互作用的结构域 寻找新蛋白寻找新蛋白、多肽多肽 探针标记探针标记 与提取物温育与提取物温育 非变性非变性PAGE 放射自显影放射自显影3. 凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验Gel shift assaysOne way of determining if a particular s

31、equence of DNA is involved in transcription factor binding is gel retardation or gel shift assays. The DNA fragment is mixed with nuclear proteins. If one or more of these bind to the DNA fragment, its mobility in a polyacrylamide or agarose gel will be decreased. This can be easily detected by comparing it with a control sample without added protein. To investigate the specificity of the reaction, we can add different amounts of protein to ensure that there is a linear dose relationship