基因工程技术课件.ppt
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- 基因工程 技术 课件
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1、文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。Jackson, Symons,and Berg (1972) generated first recombinant DNA molecules Cohen and Boyer (1973) produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors carriers of foreign DNA The Nobel Prize in Chemistry 1980文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿
2、;如有不当之处,请联系本人改正。定义:定义:基因工程(基因工程(gene engineeringgene engineering) 重组重组DNADNA技术技术(recombinant DNA techniquerecombinant DNA technique):是指在各种酶):是指在各种酶的作用下,将细胞外的核酸片断(目的基因)在体外与病毒、细菌的作用下,将细胞外的核酸片断(目的基因)在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNADNA分子,将其导入受体分子,将其导入受体细胞并使之无性繁殖(称之为细胞并使之无性繁殖(称之为“克隆克隆”)和)
3、和 表达表达,这种有目的的,这种有目的的应用分子克隆技术应用分子克隆技术, ,人为的改造基因人为的改造基因, ,改变生物的遗传性状的系列过改变生物的遗传性状的系列过程程, ,总称为基因工程总称为基因工程文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。基因克隆基因克隆(gene cloning )(gene cloning ):是指目的基因与载体是指目的基因与载体DNADNA连接构成的连接构成的DNADNA重组体在受体细胞重组体在受体细胞内进行复制、扩增的技术内进行复制、扩增的技术。基因表达基因表达(gene expression)(gene expression):是指
4、目的基因在受体细胞内表达,研究功能。是指目的基因在受体细胞内表达,研究功能。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。应用:克隆感兴趣基因进行序列分析,研究其组织结构。转入原核表达载体,进行大规模蛋白质合成,生产多肽产品。转入真核表达载体,导入细胞,研究其功能,表达调控机制等文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。基因工程基本基因工程基本步骤步骤:分、切分、切 目的基因目的基因 + 载体分子载体分子 转转 导入到合适的受体细胞(转化)导入到合适的受体细胞(转化)接接 构成重组构成重组DNA分子分子筛筛 筛选含有重组分子的克隆筛选含有
5、重组分子的克隆鉴鉴 鉴定重组分子片段鉴定重组分子片段 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。基因工程流程示意图基因工程流程示意图文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。构建重组分子(连接)构建重组分子(连接)原料原料:目的基因:目的基因:研究对象研究对象载体:载体:目的基因的运载工具目的基因的运载工具工具酶:工具酶:连接酶、限制性内切酶连接酶、限制性内切酶 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。目的基因片段目的基因片段来源来源:基因组基因组DNAPCR 方法扩增特定的目的基因片段(已知基因序列,
6、方法扩增特定的目的基因片段(已知基因序列,已有其它表达或克隆构建或从商品化的已有其它表达或克隆构建或从商品化的cDNA文库扩文库扩增)增)通过通过RT-PCR 方法得到目的基因方法得到目的基因cDNA人工合成基因片段(价钱昂贵)人工合成基因片段(价钱昂贵)文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。目的基因目的基因来源选择来源选择:取决于解决什么问题?取决于解决什么问题?基因功能研究基因功能研究 cDNART-PCR基因表达调控的研究基因表达调控的研究基因组DNAPCR文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。PCR:引入合适的酶切位点
7、,一个引入合适的酶切位点,一个/两个。两个。加保护碱基,加保护碱基,1-3个。个。加上想要的标签,如加上想要的标签,如 Flag, Myc, His, HA。启始及终止密码子。启始及终止密码子。高保真聚合酶:高保真聚合酶:HF, Pfu, Probest 等。等。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。片断的回收与纯化片断的回收与纯化文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。载体:载体:载体(Vector)是目的基因的运载工具,其作用是将目的基因带入受体细胞中,并使目的基因扩增和表达。种类:按来源分: 质粒载体(plasmid ve
8、ctor)、噬菌体载体(phage vector)、柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ).按作用分:克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、穿梭载体(shuttle vector)文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。克隆载体克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建(PBR322)。表达载体表达载体(expre
9、ssion vector) 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞,使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译(pCDNA3)。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。穿梭载体穿梭载体(shuttIe vector) 能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体. 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的 复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS),它即能在 原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用 于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。质粒载体质粒
10、载体具有具有复制起始点复制起始点,这是质粒自我增,这是质粒自我增殖的必要条件。殖的必要条件。具有较小的分子量,较高的拷贝数,具有较小的分子量,较高的拷贝数,是一个是一个松弛型松弛型的质粒。的质粒。具有某种具有某种选择性标记选择性标记以区别转化和以区别转化和非转化细胞。大多是一些抗菌素抗非转化细胞。大多是一些抗菌素抗性基因,赋予受体细胞对某些抗生性基因,赋予受体细胞对某些抗生素的抗性,为转化子选择提供便利。素的抗性,为转化子选择提供便利。(Ampr;Tetr)具有若干限制性内切酶具有若干限制性内切酶单一单一识别位识别位点,便于外源基因插入。点,便于外源基因插入。 是细菌染色体外能够自我复是细菌染
11、色体外能够自我复制的双链环状制的双链环状 DNA 分子。分子。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。克隆载体克隆载体: : PBR322 特点:特点:分子量小,分子量小,4.3kb,便于操作。,便于操作。有两个抗性基因,便于转化子筛选。有两个抗性基因,便于转化子筛选。有几个常用的限制性内切酶的单一位点,分布在抗性基因上,有几个常用的限制性内切酶的单一位点,分布在抗性基因上,7种位于种位于四环素选择标记上,四环素选择标记上,4种位于种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性,导致抗性基因抗性基因的完整性,导致抗性
12、基因插入失活插入失活,这种特性可用于区分重组,这种特性可用于区分重组和非重组分子。和非重组分子。松弛性质粒,在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数,当细菌蛋白质合成停松弛性质粒,在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数,当细菌蛋白质合成停止时,它仍能继续复制。止时,它仍能继续复制。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。TA TA 克隆克隆AA文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。TOPO-TA文档仅供参
13、考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。原核原核 His-tag: pQE系列系列(Qiagen), pET22(Novagen) GST-tag: pGEX系列系列(Pharmacia)表达载体:表达载体:带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件,如启带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件,如启 动子等,这些调控元件应与宿主细胞相适应。动子等,这些调控元件应与宿主细胞相适应。 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。pCDNA3系列系列 (Invitrogen),真核表达载体:真核表达载体:大多是穿梭载体。大多是穿梭载体。文档仅供参考,不能
14、作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。pFLAG-CMV系列系列(Sigma)文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。Tet-On/Tet-Off Expression Systems 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。DNADNA分子的体外连接:方法分子的体外连接:方法 粘性末端:相同的粘性末端互相配对进行连接粘性末端:相同的粘性末端互相配对进行连接 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。两种情况:两种情况:(a)目的基因和载体目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体
15、易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5端P基团,使5端带一 OH)处理载体,可防止载体自 环化。(b)目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶 切割后连接,可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。碱性磷酸酶处理:碱性磷酸酶处理:文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系本人改正。平头末端:平头末端:(1)增加连接酶的量)增加连接酶的量 (连接酶对平末端(连接酶对平末端DNA的的Km 约高于粘性末端约高于粘性末端DNA100倍倍 (2)在末端加上一个人工接头,内含有一定的限制性内)在末端加上一个人工接头
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