(优选)细胞培养技术与应用课件.ppt
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- 优选 细胞培养 技术 应用 课件
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1、(优选)细胞培养技术与应用细胞培养细胞培养:将组织分散成单细胞,使其:将组织分散成单细胞,使其在类似于体内生存环境、适宜的体外条件在类似于体内生存环境、适宜的体外条件下的生存、生长并维持其结构与功能的技下的生存、生长并维持其结构与功能的技术。术。u培养过程中细胞不再形成培养过程中细胞不再形成组织。组织。u培养对象(培养物)是单培养对象(培养物)是单个细胞(群)。个细胞(群)。(1)概念类似、内涵相近)概念类似、内涵相近(2)培养对象、培养物的差异)培养对象、培养物的差异(3)二者无严格的界限,可以相互转化)二者无严格的界限,可以相互转化动物细胞培养动物细胞培养 植物细胞培养植物细胞培养(1)技
2、术的难度)技术的难度(2)专业的切合角度)专业的切合角度(3)关注热度和应用价值)关注热度和应用价值课程内课程内容容微生物细胞培养微生物细胞培养营养要求复杂、培养条件严格营养要求复杂、培养条件严格培养的细胞容易发生变化培养的细胞容易发生变化培养与真实的生存环境有差异培养与真实的生存环境有差异简化生长环境、方便控制因素简化生长环境、方便控制因素细胞群均一性好、大量、成本低细胞群均一性好、大量、成本低大规模生产生物制品大规模生产生物制品细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程细胞工程是现代生细胞工程是现代生物技术各环节中物技术各环节中承承上启下上启下的纽带。的纽带。细胞培养
3、细胞培养细胞工程细胞工程细胞培养技术是细细胞培养技术是细胞工程的胞工程的最基础、最基础、最核心最核心的技术。的技术。细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程用细胞生物学和分子生物学的用细胞生物学和分子生物学的理论方法,按照人们的设计,理论方法,按照人们的设计,通过通过细胞水平上的操作细胞水平上的操作,定向,定向改造细胞或生物体、创造新种、改造细胞或生物体、创造新种、加速繁育、获得产物。加速繁育、获得产物。细胞培养细胞培养细胞融合细胞融合 细胞器细胞器/核移植核移植基因转移基因转移染色体操作染色体操作细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程通过人工培养获通过人工培养获得细胞或细胞代得细胞或细胞代谢产物谢产物细胞
4、培养细胞培养细胞工程细胞工程获得具有新遗传特获得具有新遗传特性或特定属性的产性或特定属性的产物、组织或生物体物、组织或生物体细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程细胞工程是现代生细胞工程是现代生物技术各环节中物技术各环节中承承上启下上启下的纽带。的纽带。核移植、细胞培养、细胞核移植、细胞培养、细胞融合、胚胎发育综合应用融合、胚胎发育综合应用细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程无限细胞系、细胞融合、无限细胞系、细胞融合、细胞免疫的综合应用细胞免疫的综合应用细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程染色体技术、细胞培养的染色体技术、细胞培养的综合应用综合应用多多倍倍体体育育种种1907年:哈里森(年:哈里森(Harr
5、ison),蛙胚神经组),蛙胚神经组织,单玻片悬滴培养法织,单玻片悬滴培养法创始人。创始人。1923年,卡雷尔(年,卡雷尔(Carrel),卡氏瓶培养法,),卡氏瓶培养法,细胞组织生存空间的细胞组织生存空间的开拓者开拓者。1951年,年, 厄尔(厄尔(Eagle) ,体外培养动物细,体外培养动物细胞的人工合成培养基胞的人工合成培养基开发者开发者。 波米拉(波米拉(Pomerat),悬浮培养。),悬浮培养。1957年,杜尔贝科(年,杜尔贝科(Dulbecco),胰蛋白酶),胰蛋白酶消化单层细胞培养法消化单层细胞培养法先行者先行者。医学诊断与治疗医学诊断与治疗(1)疾病诊断)疾病诊断(2)细胞植入
6、治疗)细胞植入治疗羊膜穿刺术羊膜穿刺术 地中海贫血地中海贫血骨髓细胞骨髓细胞(3)药物效应检测)药物效应检测动物筛选动物筛选细胞筛选细胞筛选高效、经济、特异性高效、经济、特异性检测有毒物质检测有毒物质,把致癌、致畸形把致癌、致畸形的物质加入培养液的物质加入培养液,对培养出对培养出的细胞进行染色体的检验的细胞进行染色体的检验,进而进而推断物质的毒性;推断物质的毒性;生物制品的生产生物制品的生产疫苗疫苗激素激素干扰素干扰素单克隆抗体单克隆抗体这些都已经成为现实这些都已经成为现实动物细胞作为表达宿主,可生产蛋白质类的生物制品,病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 ;n鱼类鱼类病毒学:病毒学:病毒的分离、鉴定
7、以及病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备病毒疫苗的制备n鱼类细胞毒理学:鱼类细胞毒理学:评价样品对鱼类细评价样品对鱼类细胞的毒性胞的毒性等等n水产生物基础理论水产生物基础理论n鱼类免疫学鱼类免疫学 英国科学家胡克英国科学家胡克(R.Hook,1635-1703),27岁成为英国皇家学会领岁成为英国皇家学会领导成员导成员, 发表对木栓的观发表对木栓的观察,命名察,命名Cell。荷兰人列文虎克(荷兰人列文虎克(Antoni von Leeuwenhoek,1623-1723)用自磨镜片做成显)用自磨镜片做成显微镜第一次观察了活的细微镜第一次观察了活的细菌和原生动物。菌和原生动物。19世纪中期世纪中期
8、细胞学说细胞学说建立建立施莱登施莱登施旺施旺19世纪中期世纪中期细胞学说细胞学说建立建立施莱登施莱登施旺施旺细胞学说的要点:细胞学说的要点:1、生物体都是由细胞构成;、生物体都是由细胞构成;2、细胞由分裂产生新细胞;、细胞由分裂产生新细胞;3、细胞是生物体结构和功能、细胞是生物体结构和功能(生命活动)的基本单位。(生命活动)的基本单位。非细胞结构非细胞结构:细胞结构:细胞结构:病毒:病毒:HIV 、SARS、流感病毒、噬菌体等流感病毒、噬菌体等原核细胞:原核细胞:真核细胞:真核细胞:蓝藻蓝藻细菌细菌 放线菌放线菌支原体支原体 衣原体衣原体 立克次氏体立克次氏体所有动物所有动物除蓝藻外除蓝藻外的
9、植物的植物真菌:如蘑菇、真菌:如蘑菇、酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌生物生物原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞原核细胞与真核细胞的本质差异原核细胞与真核细胞的本质差异原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞无以核膜为界限无以核膜为界限的细胞核的细胞核有以核膜为界限有以核膜为界限的细胞核的细胞核较小较小较大较大只有核糖体一种只有核糖体一种细胞器细胞器多种复杂的细胞器多种复杂的细胞器无染色体,有无染色体,有DNADNA分子分子有染色体(有染色体(DNADNA和蛋和蛋白质构成)白质构成)原核细胞与真核细胞的本质差异原核细胞与真核细胞的本质差异圆球形、圆球形、 多面体形、多面体形、 纺纺锤形、长梭形、锤形、长梭形、
10、管状、管状、 长柱形、长柱形、 分枝状、分枝状、 不规不规则性则性 。细胞的多样性细胞的多样性支原体支原体巨型乌贼巨型乌贼神经细胞神经细胞蕨藻蕨藻鸵鸟卵鸵鸟卵卵细胞卵细胞细胞质细胞质内质网内质网核膜核膜细胞核细胞核核仁核仁线粒体线粒体高尔基体高尔基体核糖体核糖体细胞膜细胞膜溶酶体溶酶体中心体中心体叶绿体叶绿体 细胞壁细胞壁液泡液泡动物细胞与植物细胞的比较动物细胞与植物细胞的比较 细胞器细胞器动物细胞动物细胞植物细胞植物细胞 细胞壁细胞壁无无有有 叶绿体叶绿体无无有有 液泡液泡无无有有 溶酶体溶酶体有有无无 圆球体圆球体无无有有 营养方式营养方式异养异养自养自养 通讯连接方式通讯连接方式间隙连接
11、间隙连接胞间连丝胞间连丝 中心体中心体有有无无 胞质分裂方式胞质分裂方式收缩环收缩环细胞板细胞板细胞的分裂细胞的分裂细胞细胞分裂分裂受精卵受精卵两个子细胞两个子细胞四个子细胞四个子细胞细胞团细胞团细胞分裂的意义?细胞分裂的意义?单细胞生物单细胞生物个体数目增多个体数目增多细胞数目增多细胞数目增多多细胞生物多细胞生物子细胞从周围吸收营养,合成自身的组成物质、不断地长大的过程。生长的生长的结果?结果?生长生长产生了各种不同形态、功能的细胞,它们构成了生物体的各种结构,以适应环境。细胞分化的结果:细胞分化的结果:在个体发育中,由在个体发育中,由一个或一种一个或一种细胞细胞增殖产生增殖产生的后代的后代
12、,在,在形态形态、结构结构、生理功能生理功能上发生上发生稳定稳定差异差异的过程,叫细胞分化。的过程,叫细胞分化。12345细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂细细胞胞分分化化细胞生长细胞生长细胞分裂、生长、分化的结果细胞分裂、生长、分化的结果分裂:使细胞分裂:使细胞生长:使细胞生长:使细胞分化:使细胞分化:使细胞细 胞 有 寿 命 吗细 胞 有 寿 命 吗 ? ?细胞能无限制的分裂吗细胞能无限制的分裂吗? ?细胞的衰老:细胞的衰老: 一般指复制衰老,即体外培养的一般指复制衰老,即体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后,停正常细胞经过有限次数的分裂后,停止分裂,细胞形态和生理代谢活动发止分裂,细胞形
13、态和生理代谢活动发生显著改变的现象。生显著改变的现象。形态:形态:细胞水分减少导致细胞萎缩,细胞水分减少导致细胞萎缩, 体积变体积变小小。结构:结构:核增核增大大,色素积累,色素积累, 染色质固缩。染色质固缩。功能:功能:新陈代谢速度减慢新陈代谢速度减慢, 呼吸速度减慢呼吸速度减慢 (线粒体功能退化、形变)(线粒体功能退化、形变) 有些酶的活性降低有些酶的活性降低 (酪氨酸酶)(酪氨酸酶) 细胞膜通透性功能改变。细胞膜通透性功能改变。 衰老细胞的主要特征衰老细胞的主要特征细胞死亡细胞死亡自动死亡自动死亡被动死亡被动死亡( (细胞凋亡细胞凋亡) )( (细胞坏死细胞坏死) )遗传物质控制遗传物质
14、控制外界因素外界因素 最主要的一种方式,受最主要的一种方式,受Bcl-2Bcl-2家族、家族、caspasecaspase家家族等族等基因控制基因控制的主动的的主动的生理性细胞自杀行为。生理性细胞自杀行为。凋亡的起始:细胞表面的特化结构如微绒毛消凋亡的起始:细胞表面的特化结构如微绒毛消失,细胞间接触的消失,但细胞膜依然完整;失,细胞间接触的消失,但细胞膜依然完整;线粒体大体完整,但核糖体逐渐从内质网上脱线粒体大体完整,但核糖体逐渐从内质网上脱离,内质网囊腔膨胀,并逐渐与质膜融合;染离,内质网囊腔膨胀,并逐渐与质膜融合;染色质固缩,形成新月形帽状结构等形态,沿着色质固缩,形成新月形帽状结构等形态
15、,沿着核膜分布。核膜分布。凋亡小体形成:核染色质断裂为大小不等的片凋亡小体形成:核染色质断裂为大小不等的片段,与某些细胞器如线粒体一起聚集,为反折段,与某些细胞器如线粒体一起聚集,为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生许多泡状或的细胞质膜所包围。细胞表面产生许多泡状或芽状突起,逐渐形成单个凋亡小体。芽状突起,逐渐形成单个凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。细胞凋亡过程细胞凋亡过程动物个体内不同类型和寿命的细胞动物个体内不同类型和寿命的细胞I.接近于动物的整体寿命的细胞接近于动物的整体寿命的细胞,如,如神经元和肌神经元和肌肉细胞肉细胞等。等。在胚胎发育
16、终了时,这些细胞不再增加数在胚胎发育终了时,这些细胞不再增加数量,在个体的生长期中它们可增长细胞体积,以使其与量,在个体的生长期中它们可增长细胞体积,以使其与躯体成比例。它们随着个体衰老而衰老,或者由于这些躯体成比例。它们随着个体衰老而衰老,或者由于这些细胞的衰老、死亡引起个体死亡。细胞的衰老、死亡引起个体死亡。II. 缓慢更新的细胞缓慢更新的细胞,它们的寿命短于动物的平均,它们的寿命短于动物的平均寿命,如肝细胞,胃壁细胞等。寿命,如肝细胞,胃壁细胞等。III.快速更新的细胞快速更新的细胞,如皮肤的表皮细胞、红细胞,如皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等。和白细胞等。 细胞(至少是培养的细细胞(至
17、少是培养的细胞),不是不死的、而胞),不是不死的、而是有一定寿命的。它们是有一定寿命的。它们的增殖能力不是无限的,的增殖能力不是无限的,而是有一定界限的。而是有一定界限的。Leonard Hayflick (1928 )正在检查他培养的正在检查他培养的WI-38细胞细胞 体外培养细胞增殖与个体寿命的关系体外培养细胞增殖与个体寿命的关系龟龟 9090-125 175125 175水貂水貂 3030-34 1034 10鸡鸡 1515-35 3035 30小鼠小鼠 1414-28 3.528 3.5人人 胚胎胚胎 40-60 110 40-60 110 出生至出生至1515岁岁 20-40 20-
18、40 1515岁以上岁以上 10-30 10-30 早老病患者早老病患者 2-10 10-202-10 10-20细胞的无限增殖与癌变细胞的无限增殖与癌变癌癌 Cancer基因控制基因控制无限增殖无限增殖衰老死亡衰老死亡梅艳芳梅艳芳 宫颈癌宫颈癌马三立马三立 膀胱癌膀胱癌文兴宇文兴宇 肺癌肺癌罗京罗京 淋巴癌淋巴癌陈晓旭陈晓旭 乳腺癌乳腺癌肿瘤细肿瘤细胞胞正常细胞为什么会转化成癌细胞?正常细胞为什么会转化成癌细胞?癌细胞癌细胞正常细胞正常细胞原癌基因原癌基因抑癌基因抑癌基因突变突变突变突变癌基因癌基因失去抑制作用失去抑制作用不能控制不能控制(致癌因子的作用)(致癌因子的作用)不受控制,恶性增殖
19、不受控制,恶性增殖原癌基因原癌基因抑癌基因抑癌基因癌基因癌基因(1 1)物理致癌因子:)物理致癌因子:辐射(紫外线、辐射(紫外线、X射线、电离辐射等)射线、电离辐射等)致癌的外界因素致癌的外界因素(2)化学致癌因子:)化学致癌因子:无机物无机物如石棉、砷化物、铬化物、镉化物等;如石棉、砷化物、铬化物、镉化物等;有机物有机物如黄曲霉素、亚硝胺、尼古丁、甲醛、如黄曲霉素、亚硝胺、尼古丁、甲醛、 苯、联苯胺、煤焦油、苯并芘等苯、联苯胺、煤焦油、苯并芘等(3)病毒致癌因子:)病毒致癌因子: 感染人的细胞,将其基因整合进入人的基因组,感染人的细胞,将其基因整合进入人的基因组,诱发癌变诱发癌变如:如:感染
20、感染乙肝病毒乙肝病毒可诱发可诱发肝癌;肝癌; 感染感染人乳头状病毒人乳头状病毒可诱发可诱发宫颈癌;宫颈癌; EB病毒病毒是一种疱疹病毒,使儿童患是一种疱疹病毒,使儿童患淋巴癌淋巴癌、成人、成人 患患鼻咽癌。鼻咽癌。如何预防癌症?如何预防癌症? 在多细胞生物中,每个个体细胞在多细胞生物中,每个个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因,的细胞核具有个体发育的全部基因,只要条件许可只要条件许可,细胞都可发育成完,细胞都可发育成完整的个体。细胞经分裂和分化后仍整的个体。细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。具有形成完整有机体的潜能或特性。细胞的全能性细胞的全能性高度分化的高度分化的植物体细
21、胞植物体细胞具有全能性,离体植物细具有全能性,离体植物细胞在一定营养的物质、激素和其他适宜的外界条胞在一定营养的物质、激素和其他适宜的外界条件下,能表现其全能性。件下,能表现其全能性。高度分化的动物体细胞高度分化的动物体细胞也具有全能性吗?也具有全能性吗? 诱导多功能干细胞(诱导多功能干细胞(iPScell)创始人之一。)创始人之一。 2006年山中伸弥等科学家把年山中伸弥等科学家把4个转录因子通过个转录因子通过逆转录逆转录病毒载病毒载体转入小鼠的成纤维细胞,使其变成多功能体转入小鼠的成纤维细胞,使其变成多功能干细胞干细胞。这意味着未成熟的细胞能够发展成所有类型的细胞。这意味着未成熟的细胞能够
22、发展成所有类型的细胞。 2007年,他所在的研究团队通过对小鼠的实验,发现年,他所在的研究团队通过对小鼠的实验,发现诱导人体表皮细胞使之具有胚胎干细胞活动特征的方诱导人体表皮细胞使之具有胚胎干细胞活动特征的方法。此方法诱导出的干细胞可转变为法。此方法诱导出的干细胞可转变为心脏和神经细胞,心脏和神经细胞,为研究治疗多种心血管绝症提供了巨大助力,这一研为研究治疗多种心血管绝症提供了巨大助力,这一研究成果在全世界被广泛应用。究成果在全世界被广泛应用。山中伸弥山中伸弥京都大学京都大学IPS细胞研究所所长细胞研究所所长2012年,获得诺贝尔生理或医学奖年,获得诺贝尔生理或医学奖 细胞全能性高低与细胞分化
23、程度有细胞全能性高低与细胞分化程度有关,分化程度越高,细胞全能性越低,关,分化程度越高,细胞全能性越低,全能性表达越困难。全能性表达越困难。胚胎干细胞胚胎干细胞成体干细胞成体干细胞多能干细胞多能干细胞全能干细胞全能干细胞专能干细胞专能干细胞干细胞干细胞动物细胞核的全能性动物细胞核的全能性 细胞培养细胞培养是以第一流的技术为基础是以第一流的技术为基础的,没有其它可接受的标准。高深的理论的,没有其它可接受的标准。高深的理论知识本身不能产生良好的培养。我相信有知识本身不能产生良好的培养。我相信有了实践了实践才能产生满意的结果。才能产生满意的结果。动物组织培养动物组织培养 英国,华斯莱英国,华斯莱实操
24、实操理论理论动物细胞培养的难点动物细胞培养的难点1 1、营养要求复杂;、营养要求复杂;2 2、动物细胞无细胞壁,机械强度低,对、动物细胞无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感;剪切力敏感;3 3、适应环境能力差,对环境(、适应环境能力差,对环境(pHpH、溶解、溶解氧、温度、剪切力)敏感;氧、温度、剪切力)敏感;4 4、倍增时间长,生长缓慢,易受微生物、倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染。污染。动物细胞培养的基本条件动物细胞培养的基本条件(1 1)无菌条件)无菌条件无菌条件是细胞体无菌条件是细胞体外培养最基本的条外培养最基本的条件。件。当细胞放置于体外培养时,与体内相比细胞当细胞放置于体外培养时
25、,与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力,一旦丢失了对微生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或自身代谢物质积累等,可导致细胞被污染或自身代谢物质积累等,可导致细胞死亡。因此在进行培养中,保持细胞生存环死亡。因此在进行培养中,保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等,是维持细胞境无污染、代谢物及时清除等,是维持细胞生存的基本条件。生存的基本条件。蒸汽灭菌蒸汽灭菌过滤除菌过滤除菌化学灭菌化学灭菌辐射灭菌辐射灭菌火焰灭菌火焰灭菌抗生素抗生素无菌室无菌室(十万级)(十万级)无菌操作台无菌操作台(百级)(百级)着装着装视频资料视频资料污染难污染难100%避免避免及时确认污染及时确认污染采取必要措施
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