(优选)细胞培养工程绪论课件.ppt

1、（优选）细胞培养工程绪论2教学计划教学计划1绪论 细胞结构与生理42细胞培养基43细胞培养理论44生物反应器 - 传动现象45生物反应器 - 传质现象 46细胞培养模式与调控47生物反应器控制理论48发酵工程（或蛋白质纯化） 考试4细胞培养工程南开大学药学院 3动物细胞培养过程张元兴等 2007参考书参考书动物细胞培养基本技术指南 (第5版) Bioprocess Engineering PrinciplesPauline M. Doran 1995 Basic Bioreactor Designvant Riet & Tramper 1991Cell Culture Bioprocess E

2、ngineering Wei-Shou Hu 2012细胞培养工程元英进 20124 http:/ 论论 5 根据中华人民共和国药典，药品分三类1. 中药2. 化学药3. 生物制药（目前主要是蛋白质药物、疫苗等） 美国 FDA 将药品也分三类为1. 小分子药物（化学药）2. 大分子药物（蛋白质药物、疫苗等）3. 细胞药物（干细胞、组织工程、免疫治疗等）2. & 3. 皆为生物药67后现代药学发展理念后现代药学发展理念 生命科学的快速发展，推动了以化学为主体的传统药学研究模式向以生命科学与化学相结合的新模式转变； 以分子生物学和细胞生物学为代表的现代生物学基础研究与生物技术实践虽然只有短短几十年

3、，对新药（包括大分子药物和细胞）的发现、研究、生产、质量管理和药品临床应用等方面均产生了重要影响； 以现代生物技术手段生产的蛋白质多肽类药物在临床上的成功应用，使医药生物技术成为生物技术领域发展最快、效益最高、最有发展前景的应用领域； 动物细胞培养工程是衔接现代生物学理论、新发现与化学工程原理，并应用于复杂蛋白质药物研发、生产和新型细胞治疗技术的关键环节和重要技术手段。7动物细胞培养动物细胞培养8 在体外培养动物细胞的专门技术，即在无菌条件下，（1）从机体中取出组织或细胞（原代细胞），或（2）利用已经建立的动物细胞系（细胞株），在模拟机体内生理状态的基本环境条件下，让细胞在培养容器（培养皿或生

4、物反应器）中生存、生长和繁殖的方法； 基础研究：细胞培养在现代生物学研究中广泛使用、不可或缺的实验技术； 生物产业：大规模商业化生产。9 9细胞培养：基础研究应用细胞培养：基础研究应用细胞培养：基础研究应用细胞培养：基础研究应用 简化环境条件，排除体内实验复杂影响因素，便于应用生物、物理、化学等外界因素，探索和揭示细胞生命活动的基本规律； 便于应用各种技术和方法，研究和观察细胞结构与功能的变化； 通常采用小型培养容器（如培养皿，96 孔板等），培养基一般含有动物血清（如小牛血清，5-20%），细胞贴壁，静止培养。10细胞培养：医药研发应用细胞培养：医药研发应用 现代新型药物开发必须依循生物学原

5、理（生理作用机制），并尽可能利用（1）相关药物作用靶点（生物大分子，目前主要是蛋白质如鸦片受体）或（2）载有靶点的工具细胞为评估对象，减少药物发现的盲目性，提高药物设计与筛选效率； 药物作用的细胞模型（具有商业价值） 减少实验动物的使用 使药物筛选微型化、高通量化、自动化，使信息采集效率大幅提高11细胞培养工程细胞培养工程12 细胞培养工程是以动物细胞为对象，研究在体外培养环境中细胞生长与产物合成的关系（动力学），并利用化学工程原理指导优化生物反应器的搅拌、通氧、反应器操作模式以及培养环境控制，关乎产物质量（大分子药物质量标准远比小分子复杂）、生产效率、生产成本； 细胞培养工程是应用大规模细胞

6、培养技术从事生产过程工艺开发和过程放大的重要工程理论。大规模生产过程（上千升或更大）将细胞至于完全不同的生长环境，细胞在可控的生长环境中（生物反应器）经历机械搅拌、通氧并对环境做出生理调整。如何控制细胞生长环境以满足细胞生理需求、达到最高生产效率，需要化学工程原理与细胞生理的紧密结合。1313大规模细胞培养技术大规模细胞培养技术 目前生物制品商业化生产的最重要工业技术，使众多疾病得到前所未有的治疗 蛋白药物：抗体，血液蛋白，细胞因子，疫苗 病毒：疫苗，基因治疗载体 细胞治疗与再生医学等新兴治疗直接受益 干细胞与组织工程 原代细胞体外扩增与分化 组织工程部件体外构建 细胞治疗： 免疫治疗等大规模

7、细胞培养技术的发展脉络大规模细胞培养技术的发展脉络组织与细胞培养组织与细胞培养病毒疫苗细胞天然分泌物有血清贴壁培养生化制药生化制药脏器药物提取胰岛素，白蛋白等深层发酵技术（搅拌，通氧）深层发酵技术（搅拌，通氧）WWII，开启抗生素、氨基酸、维生素、酶等新工业重组人蛋白质表达（重组人蛋白质表达（E.coli）胰岛素，生长激素，G-CSF，-干扰素，淋巴介素-2高分子量基因可能有问题缺乏翻译后修饰，尤其是二硫键连接与糖基化微生物发酵微生物发酵厌氧发酵技术厌氧发酵技术WWI，有机溶剂（炸药干燥）多种反应器设计无血清培养基研发无血清悬浮培养无血清悬浮培养重病毒疫苗组人蛋白质表达翻译后修饰大规模无血清悬

8、浮大规模无血清悬浮重组人蛋白质表达病毒疫苗改进搅拌式反应器设计解决细胞损伤无细胞（无细胞（Cell free）蛋白质表达）蛋白质表达E.coli 胞浆加入伴侣蛋白可以二硫键连接生物制药历史回顾生物制药历史回顾 生物技术发展简史 疫苗 生化制药（脏器药物）15生物技术发展简史：生物技术发展简史：传统生物技术传统生物技术 人类传统酿造技术有数千年历史，但直到显微镜的发明，人类才获知微生物的存在，并进一步获知 “酵素”（酶）的存在； 工业微生物：19 世纪末到 20 世纪 30 年代，微生物发酵生产初级代谢产品，如乳酸、乙醇、丙醇、丁醇、柠檬酸（WWI 用于炸药干燥）及淀粉酶（蛋白质）等。16生物技

9、术发展简史：近代生物技术生物技术发展简史：近代生物技术 青霉素 1928 年 Fleming 发现青霉素，放线菌次级代谢产物； 1939 年 Florey & Chain：提取纯化、临床试验； 1941 年，英美联合开发青霉素生产工艺，用于 WWII 伤员感染治疗 1943 年，生产 1 公斤 20% 含量青霉素 表面培养法 80,000 个 1 L 摇瓶 劳动力消耗巨大（清洗、装料、灭菌、接种、培养、出料等操作）17生物技术发展简史：近代生物技术生物技术发展简史：近代生物技术 青霉素生产工艺的技术革命：深层发酵技术：深层发酵技术：5,000 L，搅拌式发酵罐；放线菌菌种诱变、选育；发酵（培养

10、）过程优化；提炼技术及其设备等方面；产品产量和质量都大幅度提高，生产效率明显提高，成本显著下降；促进发酵工程技术成为近代生物制药工业的基础技术。18生物技术发展简史生物技术发展简史 ：近代生物技术近代生物技术 深层发酵技术深层发酵技术的广泛应用 抗生素工业：链霉素、金霉素、红霉素等 氨基酸发酵工业：上世纪五十年代 酶制剂工业 环境保护技术 主要产品医药药品：抗生素、维生素、甾体激素、氨基酸等；食品工业：酶制剂、氨基酸、酵母、啤酒等；化学工业：醇类、有机酸、农药等。19生物技术发展简史生物技术发展简史 ：近代生物技术近代生物技术 生物分离（下游过程）技术与设备 离子交换技术 凝胶色谱技术 膜分离

11、技术 亲和色谱技术 1952年获诺贝尔化学奖（分溶层析法）20Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge生物技术发展简史：生物技术发展简史：近代生物技术近代生物技术 疫苗工业 1796 年：牛痘疫苗 1930 年代： 小鼠脑组织或鸡胚培养繁殖病毒方法 黄热病、流脑、乙脑、森林脑炎和斑疹伤寒疫苗 1950 年代： 离体细胞培养物中繁殖病毒的技术； 小儿麻痹症、麻疹、腮腺炎等新疫苗。2122骨髓灰质炎疫苗骨髓灰质炎疫苗 骨髓灰质炎病毒 阳性 mRNA 病毒 7,500 核甘酸，编码唯一（壳）蛋白质 直径 30 纳米 结构最

12、简单病毒 骨髓灰质炎（小儿麻痹症） 病毒从口腔进入，感染肠道黏膜上皮细胞并繁殖，经血液进入大脑或脊髓 感染源为病患粪便和口鼻分泌物 儿童较成年人更易感，导致终生残废2323 骨髓灰质炎病毒体外繁殖 1948 年 3 月，Weller 在设法用人胚胎肺细胞培养制备水痘病毒的实验中，将多余的几个试管接种了骨髓灰质炎病毒； 前者失败，后者为体外制备病毒成功先例； 54 年诺贝尔生理医学奖Enders Weller Robbins Jonas Salk（1914 1995） 骨髓灰质炎灭活疫苗（Salk vaccine） 1952 年 Vero cell line（猴肾）培养 接种骨髓灰质炎病毒 福尔

13、马林灭活 1955 年正式投入预防使用骨髓灰质炎疫苗骨髓灰质炎疫苗 主要人类病毒疫苗主要人类病毒疫苗24DiseaseSource of vaccineViral conditionPoliomyelitisTC (human diploid cell line, monkey kidneyLive attenuated, inactivatedMeaslesTC (chicken embryo)Live attenuatedMumpsTC (chicken embryo)Live attenuatedRubellaTC (duck embryo, rabbit or human diploi

14、d)Live attenuatedSmallpox (vaccinia)Lymph from calf or sheep (glycerolated, lyophilized)Live vacciniaSmallpox (vaccinia)Chorioallantois, TC (lyophilized)VacciniaYellow feverTC and eggs (17D strain)Live attenuatedInfluenzaHighly purified subunit forms of chicken embryo allantoic fluid (formalinized U

15、V irradiated)InactivatedInfluenzaCC (MDCK, Vero)AttenuatedRabiesDuck embryo, rabbit or human diploidInactivatedAdenovirusCC (Human diploid cells)Live attenuatedJapanese B encephalitisMouse brain (formalinized), CCInactivatedVenezuelan equine cephalomyelitisGuinea pig heart cell cultureLive attenuate

16、dEastern equineChicken embryo cell cultureInactivatedWestern equineChicken embryo cell cultureInactivatedRussian spring-summer encephalitisMouse brain (formalinize)InactivatedTC - tissue cultureCC - cell cultureSource: Cell Culture Bioprocessing Engineering, 2012生物技术发展简史：生物技术发展简史：近代生物技术近代生物技术25 生化制药

17、： 早期蛋白质药物生产，采用生化分离技术，从生物体构成中分离、纯化、制备用于疾病预防、治疗和诊断的生物活性物质 原上海长城生化制药厂（1980）： 抑肽酶：牛肺脏，胰蛋白酶抑制剂，胰腺炎 细胞色素 C：猪心脏，营养不良现代生物技术现代生物技术 基因重组蛋白质表达技术 1953 年：DNA 双螺旋结构； 1966 年：破译了 DNA 三联体密码，随之证明遗传的中心法则； 1973 年：建立了体外重组 DNA 方法； 1982 年：重组人胰岛素投放市场，由此开启重组蛋白质药物时代重组 DNA 技术日臻成熟；微生物发酵技术；大规模细胞培养技术；人类基因组计划。26从生化制药到生物技术制药从生化制药到

18、生物技术制药 胰岛素（Insulin） 人血清白蛋白（HSA）2728胰岛素胰岛素 1921年由 Banting & Macleod 发现 1955年 Sanger 测定牛胰岛素氨基酸序列 A 链（21 AA）， B 链（30 AA） 二硫键连接：A 链与B 链之间两对， A 链内部一对 胰岛素的生理过程：1. 胰岛素基因区位于第11对染色体短臂2. 胰岛 细胞核 DNA 向 mRNA 转录，mRNA 从细胞核移向细胞浆内质网，转译成前胰岛素原（105 AA）3. 经过蛋白水解酶剪切生成胰岛素原（86 AA）；4. 胰岛素原随细胞浆微泡进入高尔基体，由蛋白水解酶剪切生成胰岛素和 C 肽；5.

19、在血糖刺激之下， 细胞分泌胰岛素，进入血液循环 29非人源胰岛素的临床应用非人源胰岛素的临床应用 第一代胰岛素第一代胰岛素（动物胰岛素） 1922 年动物胰岛素开始用于糖尿病临床治疗 直至 80 年代初，医用胰岛素都是来自猪、牛胰脏提取 不同种属哺乳动物胰岛素分子的氨基酸序列和结构稍有差异，其中猪胰岛素与人的最为接近（1-4个AA 差异） 主要问题 容易发生免疫反应，包括过敏反应和抗异源胰岛素抗体形成（胰岛素作用失效，与胰岛素抵抗不是一码事） 注射部位皮下脂肪萎缩或增生 容易反复发生高血糖和低血糖30人胰岛素人胰岛素 第二代胰岛素第二代胰岛素 20 世纪 80 年代，通过基因工程（重组 DNA

20、 技术）将人胰岛素基因转染至细胞表达高纯度的合成人胰岛素；酵母：微生物发酵过程中国仓鼠卵巢（CHO）细胞：动物细胞培养 免疫反应低，较少诱发免疫反应（包括过敏反应），注射剂量比动物胰岛素平均减少 30%，皮下脂肪萎缩的现象也随之减少； 人胰岛素的稳定性高于动物胰岛素； 主要问题：在起效时间、峰值时间、作用持续时间上仍不能模拟生理性胰岛素分泌模式，使用也不方便31人胰岛素类似物人胰岛素类似物 第三代胰岛素第三代胰岛素 20 世纪 90 年代末，基于对人胰岛素结构与功能的深入了解，研制更适合人体生理需要、更方便使用的胰岛素类似物 利用基因工程技术改变胰岛素肽链上某些位点的氨基酸组合（蛋白质工程），

21、改变等电点，增加六聚体强度； 以钴离子替代锌离子； 在分子中增加脂肪酸链，加大与白蛋白的结合； 口服剂型（肠道生物利用率过低）32人血清白蛋白（人血清白蛋白（HSA） 理化性质： 单链多肽（585 AA） 分子量 66kD 血浆唯一非糖基化蛋白质 浓度范围 35-50 g/L 含量约占血浆总蛋白的 60% 生理特性： 在肝脏合成，半衰期约为 20 天； 维持血液正常的渗透压； 运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和非水溶性药物分子等33人血清白蛋白（人血清白蛋白（HSA） 在临床上，人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容

22、剂； 适应症：用于失血性休克、脑水肿、流产引起的白蛋白缺乏、肾病等； 用量用法：静注或静滴：用量视病情而定； 规格：注射液，每支（瓶）25% 20 ml。34天然人血清白蛋白的提取纯化工艺天然人血清白蛋白的提取纯化工艺British Journal of Anaesthesia 85(6): 887-95 (2000)现代纯化技术现代纯化技术35人血清白蛋白（人血清白蛋白（HSA） 从人血清提取白蛋白的主要问题 生物污染风险：传染病原体如 HIC、HBV、HCV 等 高原料成本：人血浆原料昂贵，来源有限 杂质：杂质种类多，含量高 生产成本：纯化成本一般占生产成本的 50% 以上36人血清白蛋白

23、（人血清白蛋白（HSA） 基因工程酵母大规模发酵：酵母属于微生物，易培养，繁殖快，遗传背景比较清楚，便于基因工程操作1. 构建 HSA 基因表达载体；2. 转染酵母细胞；3. 酵母细胞将 HSA 基因转录、翻译成多肽链；4. 酵母细胞具有真核细胞的蛋白质翻译后加工能力，包括多肽链正确折叠（蛋白质活性）的胞内环境和糖基化修饰系统（对某些蛋白质活性至关重要），但 HSA 无需糖基化；5. 酵母细胞具有蛋白质产物分泌机制，无需破碎细胞，产物浓度高，杂质含量低，利于降低纯化难度和成本；6. 酵母大规模发酵属于成熟工业技术；7. 生物污染风险极低。37生化制药的局限性生化制药的局限性原料来源有限，尤其是

24、种属特异性高的药用蛋白（如 hGH）即使是异种属蛋白质药物（如猪胰岛素），目标蛋白质在原料中的含量相对极低，而且杂质种类多、总含量高，不利于目标蛋白质的纯化，回收率低，因此生产效率低下，成本高，不利于商业化生产并满足市场需求（纯化成本一般占生产成本 50% 以上，牢记）原料来源：依原料性质而论安全风险：原料生物污染 疯牛病 / 病毒污染 / 其它微生物污染 猪很可能是人-禽类病毒传染的媒介避免动物来源原料是生物制药行业的总体趋势避免动物来源原料是生物制药行业的总体趋势38生物技术制药的优越性生物技术制药的优越性 开发安全、高效、低成本生产工艺，始终是促进生物制药行业发展的主要推动力 原料：来源

25、稳定，不受季节影响，成分明确，非动物 工艺：过程重复性好，生产稳定，过程可放大以满足大规 模商业化生产 产率：目标蛋白质浓度高，益于纯化，高收率 杂质：宿主细胞蛋白 药物安全性： 免疫原性：非人源糖型有可能诱导免疫反应 宿主内源性病毒明确（如啮齿类逆转录病毒颗粒），纯化工艺将其控制在安全范围之内 宿主细胞蛋白质、DNA 控制在安全范围 从生产原料上阻断生物污染（如病毒）39 在蛋白质药物商业化生产中，借助于基因工在蛋白质药物商业化生产中，借助于基因工程技术，细胞培养技术与微生物发酵技术大规模程技术，细胞培养技术与微生物发酵技术大规模表达生产重组蛋白质药物，不但无限拓宽了蛋白表达生产重组蛋白质药

26、物，不但无限拓宽了蛋白质药物品种，也能在质量控制体系（质药物品种，也能在质量控制体系（GMP）的框）的框架之内高效、低成本生产重组蛋白质药物，几乎架之内高效、低成本生产重组蛋白质药物，几乎全面取代生化制药（脏器药物提取）。全面取代生化制药（脏器药物提取）。基因工程（重组基因工程（重组 DNA 技术）技术） 以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA 片段，转基因），按预先设计的蓝图（基因表达载体），在体外构建成杂交 DNA 分子，然后导入活细胞，以细胞自有机制对转基因进行转录、翻译，甚至后修饰、分泌。 宿主细胞选择 原核：E.coli 真核：哺乳动

27、物、昆虫、酵母404141遗传信息传递遗传信息传递42蛋白质结构蛋白质结构 一级结构一级结构：按照基因上遗传密码的排序，不同氨基酸通过肽键连接成线性序列； 二级结构二级结构：依靠不同氨基酸之间的 C=O 和 N-H 基团间的氢键形成的稳定结构，主要为 -螺旋和 -折叠等； 三级结构三级结构：通过多个二级结构元素在三维空间的排列所形成的一个蛋白质分子的三维结构（蛋白质分子或亚基）。 四级结构四级结构：用于描述由不同多肽链（亚基）间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子。43蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰 在翻译完成之后，前体蛋白通常没有活性，需要一系列的翻译后加工步骤，才能具有生物学功能； 翻

28、译后加工类型： N-端 Met 的切除 二硫键的形成 肽链剪切 化学修饰：引入官能团，以改变蛋白质的化学性质磷酸化、硫酸化、醋酸化、烷基化、乙酰化、生物素化、硫辛酸化等糖基化：糖蛋白质普遍存在44蛋白质糖基化蛋白质糖基化 蛋白质与寡糖结合方式： 数十个基因参与 O-糖苷键：丝氨酸、苏氨酸的羟基与糖的半缩醛羟基 N-糖苷键：天冬酰胺的酰胺基与糖的半缩醛羟基 同一糖基化位点糖基结构可能不同（microheterogeinity） 并非所有糖基化位点全部占用，同蛋白分子可能有不同糖基化组合（ macroheterogeinity）45蛋白质糖基化蛋白质糖基化 糖基化对蛋白质的影响： 细胞内：糖基化在

29、肽链（ER）翻译与折叠的同时即已开始，以影响多肽的溶解性、聚集和折叠产物的稳定性 糖基化对蛋白质分子在血液循环中的半衰期影响甚大 非糖基化蛋白质比糖基化蛋白质更快被肝脏截获， 糖链末端唾液酸化可以降低肝脏对蛋白质的截获 糖基化为许多蛋白质生物活性所必需 IgG：与补体和 Fc 受体结合（ADCC）所必需 Epo：生物活性所必需46蛋白质糖基化蛋白质糖基化 糖基的免疫原性（Antigenicity） 绝大多数蛋白质药物系糖蛋白质； 细胞内糖基化酶系高度保守，糖型具有种属特异性； 非人细胞所表达蛋白质有可能因糖型差异而引发免疫反应，诱导体内产生抗体，其后果是蛋白质药物被抗体中和而失效； 重组蛋白质

30、药物生产必须采用适当细胞株，避免或最大限度降低由糖基引起的免疫原性47重组蛋白质药物表达主要细胞（株）重组蛋白质药物表达主要细胞（株）来来 源源细胞（株）细胞（株）注释注释中国仓鼠Chinese Hamster Ovary （CHO）由于历史原因，CHO 细胞是目前采用最多的生产细胞株。非人源糖型，免疫原性未引起大问题人HEK293, Per C6人源糖型，潜力巨大小鼠NS0, SP2/0, hybridomas非人源糖型，免疫原性很低叙利亚仓鼠BHK昆虫Sf9, Hi-Five非人源糖型，疫苗（抗原）表达酵母毕赤酵母非人源糖型，非糖基化蛋白质或疫苗（抗原）表达细菌大肠杆菌形成包涵体，非糖基化

31、、无二硫键蛋白质表达，二硫键可在氧化复性环境或伴侣蛋白协助下形成4848Molecular Cell Biology (5th ed.) by Lodish et al.原核细胞 - 真核细胞49491. 蛋白质产物分子量 真核：基本上对分子量没限制 原核：适合表达分子量低于 5 KD 的蛋白质多肽2. 翻译后修饰机制 真核：YES，但种属差异很大 原核：NO 后修饰为许多蛋白质功能所必需如抗体、促血红素3. 产物分泌机制 真核：YES，蛋白质以天然构象形式分泌至胞外 原核： NO，缺乏多肽链正确折叠与二硫键正确连接的机制，多肽以包涵体形式存在，后续加工包括细胞破碎、包涵体溶解、蛋白质复性，工

32、艺复杂，成本高真核与原核细胞基因表达的主要差别真核与原核细胞基因表达的主要差别生物技术药物的特性生物技术药物的特性 1. 分子结构复杂： 分子量较大； 分子结构复杂，除肽链之外，可能还有二硫键连接以及翻译后修饰如糖基化、磷酸化等2. 具有种属特异性：3. 治疗针对性强、疗效高： 生物药物是天然存在的蛋白质或多肽，量微且生物活性强，极小用量就会产生显著效应，相对来说不良反应较少，毒性较低，安全性较好；4. 稳定性低： 易变性失活，易被蛋白酶破坏，易微生物污染；50生物技术药物的特性生物技术药物的特性 5. 基因稳定性： 生产菌株或细胞系的稳定性和生产条件的稳定性非常重要，变异会导致药物生物活性的

33、变化或不希望的生物学活性。6. 免疫原性： 一些人源性蛋白质在人体中也能产生抗体，重组药物可能与天然蛋白质存在结构和构象上的差异；7. 体内半衰期短： 生物药物降解迅速，体内降解的部位广泛；8. 受体效应： 许多生物药物是通过与特异性受体结合、信号传导机制而发挥药效作用，且受体分布具有动物种属特异性和组织特异性，因此在体内有组织特异性和药效反应快的特点；51生物技术药物的特性生物技术药物的特性 9. 多效性和网络性效应： 许多生物药物作用于多种组织或细胞，且在体内相互诱生、调节、协同或颉颃，形成网络效应，从而具有多种功能、多种药理作用；10. 检验的特殊性： 生产系统复杂，生产批次间的一致性及

34、安全性的变化大于化学产品，因此，对生产过程的监测、GMP 步骤的要求和质控的要求更为重要和严格。52非动物宿主细胞生产蛋白质药物非动物宿主细胞生产蛋白质药物53Drug (Trade name)Activity / UseGranulocyte colony-stimulating factor (Neupogen)White blood cell growth for neutropeniaInsulin (Humulin)Diabetes-Interferon (Intron-A)Anticancer, viral infectionsSomatotropin (Humatrope)Gro

35、wth deficienciesSomatotropin (Protopin/Nutropin)Growth deficienciesInterleukin-2 (Proleukin)Kidney cancerSource: Cell Culture Bioprocessing Engineering, 2012动物细胞表达非抗体蛋白质药物动物细胞表达非抗体蛋白质药物54Source: Cell Culture Bioprocessing Engineering, 2012Trade nameTypeTherapeutic useManufacturerUS approvalHostActiv

36、aseTissue plasminogen activatorAcute myocardial infarctionGenentech1987CHOEpogen/ProcritEPOAnemiaAmgen/Ortho Biotech1989CHOPulmozymeDeoxyribonuclease ICystic fibrosisGenentech1993CHOCerezyme-glucocerebrosidaseGauchers diseaseGenzyme1994CHOAvonexInterferon-Relapsing multiple sclerosisBiogen Idec1996C

37、HOFollistim/Gonal-FFollicle stimulating hormoneInfertilitySerono/NV Organon1997CHOEnbrelTNF receptor fusionRheumatoid arthritisAmgen, Wyeth1998CHOBenefixFactor IXHemophilia AWyeth2000CHOTenecteplaseTissue plasminogen activator (engineered)Acute myocardial infarctionGenentech2000CHOReFactoFactor VIII

38、Hemophilia AWythe2000CHOAranespEPO (engineered)AnemiaAmgen2001CHORebifInterferon-Relapsing multiple sclerosisSerono2002CHOFabrazyme-galactosidaseFabry diseaseGenzyme2003CHOAdvateFactor VIII (engineered)Hemophilia ABaxter2003CHOLuverisLuteinizing hormoneInfertilitySerono2004CHONaglazymeN-acetylgalact

39、osamine 4-sulfataseMucopolysaaccharidosis VIBioMarin2005CHOOrenciaIg-CTLA44 fusionRheumatoid arthritisBristol-Myers Squibb2005CHOMyozyme-galactosidasePompes diseaseGenzyme2006CHOAldurazymeLaronidaseMucopolysaaccharidosis IGenzyme2006CHO动物细胞表达抗体药物（早期）动物细胞表达抗体药物（早期）55Source: Cell Culture Bioprocessing

40、 Engineering, 2012Trade nameMab TypeTherapeutic useManufacturerUSHostOKT3Anti-CD3, MurineAcute kidney transplant rejectionJ&J1986HybridomaReoProAnti-AbciximabPrevention of blood clotsCentocor1994SP2/0RituxanAnti-CD20Non-Hodgkins lymphomaGenentech1997CHOZenapaxHumanized, anti-chain, IL-2 receptorAcut

41、e kidney transplant rejectionPDL1997NS0SimulectChimeric, anti-chain, IL-2 receptorAcute kidney transplant rejectionNovartis1998SynagisHumanized, anti-A-antigen of RSVLower respiratory tract diseaseMedImmune1998CHORemicadeAnti-TNF-Active Crohns diseaseCentocor1998SP2/0HerceptinAnti-HER2Metastatic bre

42、ast cancerGenentech1998CHOMylotargAnti-CD33Acute myeloid leukemiaWythe2000CHOCampathAnti-CD52Chronic lymphocytic leukemiaMillennium2001CHOZevalinAnti-CD20, murineNon-Hodgkins lymphomaBiogen Idec2002CHOHumiraAnti-TNF-Rheumatoid arthritisAbbott2002CHOXolairHumanized, anti-IgEModerate/severe asthemaGen

43、zyme2003CHOBEXXARAnti-CD20Follicular Non-Hodgkins lymphomaGSK2003CHORaptivaAnti-CD11aChronic psoriasisGenentech2003CHOErbituxChimeric mAb anti-hEGF receptorEGFR expressing metastatic colorectal cancerBMS, Merck2004CHOAvastinAnti-VEGFMetastatic colorectal & lung cancerGenentech2004CHOVectibixAnti-EGF

44、RMetastatic colorectal cancerAmgen2006CHOSolirisAnti-CD5Paroxysmal nocturnal hemoglobinuriaAlexion2007NS0抗体药物抗体药物 杂交瘤细胞与单克隆抗体 Kohler & Milstein（1975）将小鼠骨髓瘤细胞（有分裂增殖能力）与免疫的动物脾细胞（B 细胞，分泌单一种抗体）融合，形成即能增殖又能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞； 抗原-抗体结合具有极高特异性与亲和力，抗体可以成为靶向药物的基础（生物导弹）。56抗体药物作用机制抗体药物作用机制57 中和效应因子：抗体与肿瘤坏死因子（TNF-）结合，

45、使其不能再与细胞表面受体结合，减缓炎症，适用于类风湿性关节炎、牛皮癣和克罗恩病； 肿瘤生物治疗：1. 抗体可以负载细胞毒性药物或放射性，在肿瘤组织上与表面抗原结合、富集、杀伤肿瘤细胞；2. 抗体锚定肿瘤组织之后，其 Fc 与天然免疫细胞（如巨噬细胞和自然杀伤细胞）表面 Fc 受体结合，诱发后者杀伤效应；3. 封闭 T 淋巴细胞表面 PD-1或肿瘤组织表面 PD-L1 ，阻止肿瘤细胞对 T 淋巴细胞的压制，达到 T 淋巴细胞对肿瘤的杀伤效应。南开大学药学院 细胞培养工程细胞培养工程Nature 480(22): 480-489, 29 December 2011Cancer immunother

46、apy comes of ageMellman, Coukos & Dranoff59 激活或抑制 T 淋巴细胞功能的抗体药物对于肿瘤治疗具有很好的前景已处于临床试验阶段抗体药物抗体药物6060抗体药物类型抗体药物类型 抗体药物类型演化 降低种属差异免疫反应 提高药效 OKT3 鼠源抗体 免疫反应使其作用失效 抗体工程： IgG 抗体结构与功能干细胞与组织工程干细胞与组织工程 特殊生物反应器 专用无血清培养基肿瘤免疫治疗（肿瘤免疫治疗（DC-CIK）626363现代动物细胞培养生物医药工业的主要技术构成 分子生物学与基因工程技术分子生物学与基因工程技术 基因表达机制 基因表达载体构建 宿主细胞

47、设计：CHO：DHFR 双敲除CHO/NS0：GS 系统PER C6，HEK293 蛋白质纯化蛋白质纯化 亲和层析：Protein-A/G; AKTA：提高纯化工艺过程开发速度和质量； 更多的树脂选择； 膜技术：过滤、浓缩。 大规模细胞培养技术大规模细胞培养技术 细胞株构建与筛选 合成培养基 无血清培养基 无蛋白培养基 无动物成份培养基 化学成份明确培养基 搅拌式生物反应器 （发酵罐）与过程放大 蛋白质表达过程方式蛋白质表达过程方式 稳定表达 瞬时表达6464H1N1 疫苗生产全过程 传统病毒疫苗生产工艺：传统病毒疫苗生产工艺： 鸡胚接种鸡胚接种 蛋源：海兰白（鸡龄 30-56 周） 每天耗费

48、鸡蛋 54000 个 H1N1病毒裂解 H1疫苗原液 3000 毫升相当于疫苗 70000 多支 副作用：卵清蛋白 病毒疫苗生产现代化工艺：病毒疫苗生产现代化工艺： 细胞无血清悬浮培养（如 Vero 细胞） 工艺要点： 细胞株对病毒敏感、产量高； 细胞生长、病毒接种时间与接种量、产物回收等； 优势：工艺稳定，效率高，无原料限制。总总 结结 细胞培养为现代医学、生物学和药学研究不可或缺的手段 细胞培养技术是生物制药产业的核心工业技术，蛋白质药物与疫苗行业在未来的国民经济中会扮演越来越重要的角色，为人类疾病诊断治疗和生活质量改善提供前所未有的可能 细胞培养工程的理论知识和实践艺术对于细胞药物（包括

49、肿瘤免疫治疗、细胞治疗、干细胞与组织工程）具有直接的借鉴作用，对新型治疗技术的创造性设计和研发具有指导作用6566人类对药的认识过程人类对药的认识过程 早期人类在生活物资的寻找活动中，经过反复尝试，对具有某些疗效作用的自然资源有了初步认识中草药，“药食同源”古印度医药古希腊医药阿拉伯医药：整合各种传统医药知识并进一步发展，为欧洲文艺复兴、发展现代医学具有衔接作用 随着科学认知与技术手段的不断深入与发展，人类在不断探索实践中发现和发明新的药物 进入21世纪，人类基因组测序完成之后，干细胞治疗、肿瘤免疫治疗、基因编辑（CRISPR）等新兴领域将把医药与医疗带入史无前例的时代67鸦鸦 片片 作为食物、麻醉和宗教活动用品，鸦片种植可以追溯到新石器时代； 外科手术麻醉止痛：古代希腊、罗马、埃及、印度、波斯和阿拉伯帝国； 唐代由阿拉伯商人输入，“或单独吞食，如服金丹；或和以他药，煎汤饮服”； 明朝成化年间（15 世纪）成为上层社会的 “娱乐药品” 17 世纪烟枪在台湾发明，“东亚病夫” 20 世纪中药：祛痰止咳 复方甘草片（含阿片） 复方甘草口服溶液（含吗啡）