ROS引发的病理过程实例分析课件.ppt

1、文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 （一）（一） 眼球晶状体结构、性质和功能的关系眼球晶状体结构、性质和功能的关系 晶状体相当于一个透镜。但是，这个“透镜”要有特殊的结构和性质以满足特殊功能的要求。首先，它必须没有吸收可见光的能力（无色的），还要没有散射光的能力，要有一定的折射率，要能变焦。这些是这个透镜的物理要求。从化学上说，应该稳定，不发生相变。从生物学上说，从胎儿到婴儿到成年，晶状体必需随年龄发育成长，那就需要细胞参与。但是这里有矛盾：既要细胞参与又要没有散射和吸收可

2、见光。如何解决？ 眼球晶状体（lens）从结构和性质上基本上满足了这些要求。粗略地说，它是由一层上皮细胞构成的膜包着一个高浓度（35%-40%）的晶状体蛋白的溶液。细胞从前方分裂，被推向两侧，转向中央，变成失去细胞核的纤维细胞。这些纤维集中在晶状体中央成为晶状体核。这样形成的晶状体在结构上和组成上的特征是： 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 （1）没有血管，否则血管和血液成分会造成光吸收和光散射。 （2）只有一层由上皮细胞构成的膜，由它们负责合成CR,并且包容晶状体。这种细胞只在生长区（前方）分裂，推动细胞，向赤道方向移动。到达赤道后，便失去分裂功

3、能，代谢停止。而此时分化开始，细胞失去核并延长成纤维，纤维向内集中成为晶状体核的一部分。到达这里，细胞分化停止。这一巧妙的机制使眼球得以发育，CR不断供应。但是这些功能的细胞不能像其他组织那样增长，始终只有一层膜上的上皮细胞在工作。 (3)CR的结构决定了它在溶液中不能有、也不能产生造成光散射的蛋白质聚合物、缔合物以及其他难溶物。一般来说, 蛋白质的巯基容易形成二硫键, 从而形成难溶蛋白质聚合物。蛋白质构象也容易改变,特别是线性分子。球蛋白构象不易变, 但它们又是在很大程度上依赖二硫键文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。结合维持构象。因此,这是一矛盾。

4、CR是一组蛋白,包括A1,A2,B1,B2,H,L,等等。在白内障病理过程中主要靶分子是CR。CR单体相对分子量28000,是可溶性球蛋白。它的结构特征是, 富含芳香氨基酸残基(色氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸)及含硫氨基酸(甲硫氨酸,半胱氨酸),但少二硫键, 少螺旋,多折叠。以上种种都为维持和保护结构,稳定构象起重大作用。(4) 在组成上,晶状体中氧分压低, 维生素C 含量高。皮质内GSH 高,其次为核,再次为上皮细胞。它们(还有SOD等酶)构成抗氧化机制, 能在一定范围内防御ROS造成氧化性损伤和交联。 (二)白内障病理过程中的靶分子 1.晶状体蛋白 CR 是主要靶分子。它富含芳香族氨基酸和含硫氨

5、基酸,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。特别是半胱氨酸残基。这些残基既是作用靶点,也起保护作用。前面讲过,要维持球蛋白构象不易变(刚性比较大),需要半胱氨酸形成的二硫键。半胱氨酸与交联二硫键之间的转变是一个可逆过程,为光辐射催化,也为ROS推动。 ROS,h CR-SH CR-S-S-CR单从这一反应看,二硫键的增加会导致交联度增加、构象改变以及分子聚集态改变。但事实上, 生活在光照之中并且不断接触ROS并没有造成晶状体内发生影响视力的变化。这是因为CR 分子有一套自我保护的结构特点,在晶状体内也有一套保护系统(如GSH、NADPH等)。因此ROS能

6、够被及时清除, 交联物能够被及时逆转。但是白内障患者晶状体蛋白的-S-S-含量增加,而且,随着病情发展,越来越不能逆转。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。甲硫氨酸残基的硫醚键可以被氧化成亚枫 : -SCH3 -S-CH3色氨酸残基在CR氧化上起两种作用。第一,它和酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基一起起着电子受体的作用。当巯基在光照下变成二硫键时,释放的电子在蛋白质结构深处, 这些电子被缺电子的芳香环接受。为-S-S-逆转为 -SH保留所需的电子,因而起着保护作用。但是,色氨酸(酪氨酸和苯丙氨酸不是)可以起光敏化剂的作用,把基态氧变成单线态氧,成为光

7、致白内障的触发环节(见后)。 虽然蛋白质的氨基不是ROS主要靶部位,但是由磷脂过氧化产生的羰基化合物,如丙二醛,可以与氨基形成 Schiff碱,使蛋白链交联,水溶性下降。不过与CR的氧化性交联比,后者贡献小。 ROSO文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.磷脂 前面已经讲过,细胞膜是一个以磷脂双层为基质的双层膜。磷脂容易在ROS作用下发生过氧化,造成膜损伤。而且通过花生四烯酸代谢级联反应产生一系列降解物,其中有些可以造成蛋白质之间、磷脂与蛋白质之间的非氧化性交联。膜损伤造成细胞内外离子平衡(ionic balance)改变,致使K+ 漏出和Na+流入

8、,Ca2+流进使细胞内游离Ca2十浓度增加,CR和其他蛋白质聚集沉淀。为抵消 Ca2+浓度增加和K+、Na+离子浓度异常,Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶必须加紧工作。因此迅速消耗ATP,造成ATP耗竭。 (三)白内障自由基机理的提出1.证据 白内障病理过程中, 晶状体的以下变化都提示ROS的参与: 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 (1)引发白内障形成的因素都可以促进ROS的产生,如紫外线、博莱霉素等。 (2)在白内障患者晶状体内可测出自由基信号,并可测出H202浓度的增高。 (3)在白内障晶状体IR-拉曼光谱中可看到 SH含量减

9、少, -S-S-含量增多。 (4)用抗氧化剂SOD可减轻白内障发展。 (5)白内障晶状体内GSH含量下降。 另外,用过氧化氢处理晶状体,使其产生白内障时,可见膜损伤引起的 Na+/K+ATP酶损伤(Na+结合部位受损),K+ 流入被抑制,细胞外K+增多,Na+对ATP 水解控制能力减少,ATP耗竭,糖酵解增加。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.GSH与白内障的关系 前面讲过,白内障晶状体内GSH含量下降。在ROS推动白内障的机理中,GSH所起的作用有几个可能 : (1)本来蛋白质与蛋白质之间容易通过巯基变成二硫键而聚集。不过,在一般情况下,GSH

10、可以使反应逆转,维持巯基状态 : PSH P-S-S-P GSSG GSH GSSG GSH 那么GSH水平的降低,就会引起蛋白质交联度的提高。GSH水平下降可以是因消耗在处理ROS中,也可以是由于其他原因。 (2)膜两侧离子平衡紊乱提示离子通道、离子泵受损伤,因为这些膜蛋白参与离子转运,也决定膜的通透性。这些文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。蛋白质的构象与装配都与它们的巯基状态有关。如前所述,维持巯基状态需GSH。(3)GSH作为GSHpx 的辅助因子, 清除过氧化氢及过氧化物。 以上3个问题虽不能作为ROS机理的直接证据,但支持ROS机理。 在晶

11、状体内有较高浓度的GSH,就是为了保护蛋白质(保护它的构象)。维持GSH 浓度的第一条件是合成。合成GSH的第一步是在-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-glutamyIcysteine synthetase)作用下,使Glu与Cys结合成-谷氨酰半胱氨酸,然后再一步与Gly结合生成GSH。这都需要ATP。大部分ATP来自糖酵解。在能量被大量消耗,缺氧情况下,ATP水平就低,GSH合成就受影响。营养不良成为白内障的危险因子可能就是因为这个原因。除GSH合成减少外,影响GSH 水平或GSH/GSSG比的另一重要文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。原因是GSH被氧化

12、。ROS和其他氧化剂都能使GSH减少,GSSG增多。但是,前面讲过,只要反应停留在GSH GSSG之间,就可以被一系列细胞内还原电势维持系统所恢复。这一系列的末一步是己糖磷酸旁路,因此与糖代谢有关。所以糖代谢有两重意义,一是与ATP有关,一是与GSH 有关。不过这并不是糖致白内障产生的主要原因。3.Spector 设想 Spector把以上所讲的几个因素联系在一起,提出了一个由ROS触发的白内障发生机理。如图1所示。他设想: 一方面,ROS损伤膜结构、改变膜通透性,影响离子平衡,消耗ATP; 另一方面,直接作用于晶状体蛋白, 使蛋白氧化交联聚集。虽然有很多证据支持ROS 的参与,但是白内障发生

13、发展过程并不像 Spector 所想的那么简单。不同白内障虽然在结果上都是CR变性,但在诱因和反应过程中均文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。代谢损伤 ATP水平下降有所不同,因此在病情发展过程中,出现的症状变化不同。下面我们就最常见的光致白内障和糖致白内障从分子水平讨论。ROS 膜损伤 膜通透性改变 离子平衡受干扰 直接对蛋白氧化 CR中高分子量 聚集物形成 图1 白内障病理过程的Spector设想(四)光致白内障的ROS机理 光致白内障是由紫外照射所引起。强紫外线照射引起的不可逆转的CR变化是这种白内障的特征; 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿

14、模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。而短时的、弱的紫外照射(实际上人总要接受一些紫外线) 引起的变化是可逆的,不能构成白内障。但小剂量长时间照射(包括老年人一生几十年中在日光下生活和工作)也易形成白内障。老人中绝大多数有不同程度的白内障,原因之一是一生中所受的低剂量照射。 光致白内障有一个独特的表现,就是晶状体核呈棕色。因此,它不只是CR交联问题。 光致白内障病理过程包括在膜、晶状体和核三个部位发生的事件。 1膜上的事件 膜上发生的事件是ROS诱导的膜损伤过程。在这里ROS基本上不是由细胞的吞噬作用产生,差不多完全是UV 照射引起的。UV照射启动自由基反应后,发生脂质过氧化并且ROS转化

15、、增殖,引起一连串反应。反应一经发生便难以文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。Na,K-ATP酶 Ca泵 蛋白质交联与聚集ATP酶负担蛋白质构象改变蛋白质结合相分离图2 光致白内障发生发展中的生物学事件 终止。 ROS以及脂质过氧化产物中的二羰基化合物向膜蛋白及晶状体内蛋白质进攻,使它们发生交联或降解。这些事件与前面讲过的原则上相同。 UV ROS 膜磷脂 脂蛋白 膜 丙二醛 膜蛋白交联降解 光敏化剂 产生1O2 胞内K+ Na+ 胞内Ca2+ 产生荧光物质 胞内水 与晶状体核 空泡 ATP消耗 光照 GSH合成减少 ROS 光散射 S-S键形成增多

16、文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.膜内外离子平衡的扰乱 这一过程和炎症时发生的相近。主要是 Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP 酶受损后工作能力下降,细胞内游离Ca2+浓度升高,K十浓度降低,Na+浓度升高。Ca2+浓度居高不下又引起一系列变化。这些都是普遍的事件。但是对眼球晶状体来说, 可能有三个后续变化与白内障有关: (1)因为Na+/K+ 泵工作能力下降后,每次少进2个K十,就少出3个Na+,所以细胞内渗透压增高,水进入细胞,细胞被破坏,形成空泡,导致相分离,光散射增加。 (2)Na+/K十泵与Ca2+ 泵为维持离子平衡,全力工

17、作,导致ATP浓度下降,GSH合成减少。虽然在别的细胞中也有这一事件, 但在这里,则因GSH 减少增加了ROS 对CR 氧化交联的程度。 (3)细胞内Ca2+浓度增加也会引起蛋白质构象改变或凝聚。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。这三者都对白内障形成有贡献,不过,都是间接的。3.晶状体内CR的交联 这是指 ROS 直接与CR 作用的结果,是所有白内障都具有的核心事件,包括疏基氧化成二硫键及与二羰基化合物缩合形成 Schiff 碱而交联等。红外和Raman光谱指示这一变化的进度。 4.晶状体核内发生的事件 这是光致白内障的特点,也是核心问题。从本质讲,

18、光致白内障的发展要有某种光敏化剂在里面起作用。这种敏化剂能吸收一定波长的紫外光,把所得能量传给基态氧,把氧变成单线态,单线态氧再去氧化CR。这一反应本身并无特点。值得注意的是通过光敏化剂传递能量不是简单的物理过程, 它是一系列化学变化的组合。我们在光致白内障文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。晶状体核中看到的棕色物质就是光敏化剂生成的荧光物质与核中的蛋白质(可能是已经交联的蛋白质)结合的产物。这种棕色蛋白质带着光敏化剂,就会在光照时继续不断地产生ROS, 把对CR 的氧化如此进行下去。 问题是光敏化剂从何而来?虽然它可以是外源的,但主要是眼球内部就有的

19、。视网膜中的视紫红质(rhodopsin)就可以吸收紫外线,把基态氧变成单线态氧。不过它的损伤部位主要在视网膜。在光致白内障发展中的前光敏化剂 (pro-photosensitizer) 可能是蛋白质中的色氨酸残基。在白内障晶状体中色氨酸残基的荧光强度下降,非色氨酸残基荧光强度相对增加提示这一可能。实验证明下面一系列变化的可能性(图3) 。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 P P P 1K 3K 3O2 图3 色氨酸的光敏化作用和活性氧的生成CH2CH-COOH NH2NHROSO2-O2C-CH2CH-COOHO NH2COCH2CH-COOH

20、NH2 NHHCONH2H2OUVUVUV犬尿氨酸荧光磷光1O2蛋白质 聚合N-甲酰基犬尿氨酸文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 色氨酸残基本身不是光敏化剂,而是产生光敏化剂犬尿氨酸(kynurenine) 的前体。第一步,色氨酸残基在光照下氧化开环,这是氧分子在光照下产生的超氧离子作用的结果 。 开 环 后 形 成 的 N - 甲 酰 基 犬 尿 氨 酸 ( N -formylkynurenine) 中的酰氨基不稳定,即水解生成犬尿氨酸。这是第二步反应。然后,便是犬尿氨酸的光敏化作用。它获得紫外线提供的能量后,分两步跃迁(lK及3K)。单线态的IK

21、可以发出荧光回到基态,3K则发出磷光返回基态。放出的能量适于基态氧转化为单线态,因此反复作用产生单线态氧,不断氧化CR 及其他蛋白质。由犬尿氨酸产生的荧光物质即与核内蛋白质结合。而且由于ROS 的作用, 蛋白质可能已经交联。所以荧光物质与已经变化的蛋白质结合而形成棕色蛋白质。 上面讲的过程只说明光敏化机理,并不是说光致白内障就是由单线态氧造成的。在光致白内障中,ROS可能起多重文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。作用,不能认为只有一种特定的过程在起作用。 。(五)糖致白内障的 ROS 机理 糖致白内障是血中葡萄糖、半乳糖等浓度长期居高不下引起的白内障。

22、除糖尿病外,有一种遗传性疾病,半乳糖血症。这种病的患者缺少一种能把磷酸化的半乳糖转化为葡萄糖的酶 半乳糖1-磷酸尿苷转移酶(galactose-l-phosphate uridyl transferase)。血中半乳糖持续浓度过高,也容易促使白内障发展。 两种情况的最终结果是相同的白内障,说明某些糖类有诱导CR交联变性的共性。 1. 生物学事件的联系 糖致白内障有两个生物学事件特征。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 (1)脏器转移。糖尿病原发部位是胰脏的胰岛部位,但由之引起血糖浓度过高,经血循环使晶状体葡萄糖浓度升高,从而把致病因子转移到眼球,发展

23、成白内障。这种从一个脏器发生的事件,通过物质传递在另一脏器产生新的病理过程很多。只要找到这个传递物质就可跟踪其来龙与去脉。两个部位的病理过程可能有先有后。比如并不是在糖尿病初期血糖一高就表现出白内障来, 这是因为造成不可逆损伤需要较长的时间过程。我们知道,损伤需要积累,而且是一慢过程。 (2) 病理过程的阶段性。粗略地说,糖尿病引起白内障的早期(那时还不能算做白内障), 可以看到血糖浓度与晶状体折光指数同步升降。这个过程是可逆的。在这个时期,为了把血糖降下来,大多数患者都服用降糖药。但是在持续用降糖药维持血糖不太高(事实上并非正常)过程中,白内障却在渐渐发展进入第二阶段。这时可见晶状体纤维文档

24、仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。细胞充水,破裂,产生空胞,视力明显减退。经过在更长时期发展以后,也可以说到第三阶段,开始见到蛋白质聚集而后成熟,形成白内障。在病理过程的可逆转性上也有阶段性。在抗氧化系统的工作能力范围内,病理过程还是可逆的、可修复的。但当这个系统调控能力渐渐降低,ROS水平长期超过它的调控能力时,病理过程变成不可逆的。病情就是这样发展的。 2. 渗透压增加说 有人曾从生物化学研究提出解释糖致白内障形成的机制。其中心环节是晶状体内糖浓度升高, 渗透压增高,从而使细胞充水、破裂。但是其中有一个难以解释的地方: 那就是既然葡萄糖是可以代谢的,

25、 也是可以透过膜而扩散出细胞的,为什么细胞内糖浓度高时糖不能被代谢掉,也不向细胞外扩散呢?文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。己糖激酶产生糖致白内障的渗透压学说的依据是葡萄糖正常代谢是在己糖激酶（hexose kinase）催化下磷酸化成葡萄糖-6-磷酸，后者再被氧化成二氧化碳。但是这条加工线处理葡萄糖的容量有限。在葡萄糖浓度超过这条限度时，多余部分就要走糖醇途径代谢，即经醛糖还原酶（aldose reductase）把葡萄糖还原成山梨醇，再在山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase)催化下，氧化成果糖。 NADP+ NADPH 葡萄

26、糖 葡萄糖-6-磷酸 CO2（正常代谢）NADPH NADP+ NADP+ NADPH 醛糖还原酶 山梨醇 山梨醇脱氢酶 果糖（糖醇途径） 渗透压说认为，经糖醇途径生成的山梨醇和果糖不能透过细胞膜，而储留在胞内，使渗透压增高。 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。血糖增高晶状体葡萄糖超过正常代谢功能多 余 的 糖经 糖 醇 途径代谢山梨醇及果糖在胞内储留为 建 立 渗透平衡Na+进，K+出胞内K+/Na+下降K+/Na+泵加紧工作ATP氨基酸漏出蛋白质合成渗透压提高水透入细胞充水、肿胀、破裂胞外葡萄糖浓度下降降糖治疗 细胞内山梨醇及果糖浓度增高时，还使

27、蛋白质合成下降。经降糖治疗后，细胞外液中葡萄糖被去除掉，相对于胞内变成明显低渗，水透入细胞，导致充水、肿胀及破裂。渗透压说只注意到细胞肿胀破裂这一方面，它的解释是物理的。但是后来注意到在病理过程中细胞有氧化性损伤，最重要的是发现巯基被氧化成二硫键。因此把活性氧氧化与渗透压改变二者结合，提出活性氧损伤机理。 图4 糖致白内障的渗透压机理 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。O2 O2- O2 O2- O2- H2O2 O2- H2O2-e-e3活性氧致病机理 如前所述，白内障发生过程中有活性氧参与，已有多种证据。问题是活性氧是怎样在血糖增高情况下产生的。

28、可以认为，糖的自氧化是自由基的来源。 OH O OH OH OH O O O CC CC CC CC通过糖的两步单电子氧化，O2分子单电子还原，生成O2-、H2O2以及OH等。 因此,把渗透压变化部分（这一部分是事实）的糖醇代谢途径与糖自氧化途径结合起来，把糖致白内障的病理过程描述如图5 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。图5 糖致白内障的自由基机理 葡萄糖自氧化糖醇途径己糖磷酸途径NADPHATPROSGSHAA合成二 羰 基化合物 膜蛋白CaATPaseNa/K ATPase膜磷脂MDAK+,Na+Ca2+蛋白质化学修饰，降解Posm脂 褐 质结 合 核蛋白聚合相分离水光散射空胞+文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 事实上，曾有人实验用超氧化物歧化酶滴眼治疗白内障有明显效果。只是因为该酶不稳定，难以在室温和光照下保存和使用，未能在临床使用。不过它支持活性氧致病机理。