PCT胶体金试纸制备及其原理课件.pptx

1、2022-4-22PCT胶体金试纸制备及其原理程骏2016年6月3号2022-4-22 胶体金的概念 胶体金的特性 免疫胶体金技术介绍 PCT相关介绍 PCT胶体金试纸制备 其它2022-4-22一、胶体金的概念胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution）：是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12），外层双层正离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。2022-4-22二、胶体金的特性1 1、胶体性质、胶体性质 金颗粒直径多在110

2、0nm，稳定、均匀、呈单一分散的状态悬浮在溶液中；胶体金对电解质的敏感性，易使胶体金的稳定状态被破坏，使单一分散的胶体金颗粒聚集成大颗粒，从溶液中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质具有保护胶体金、增强胶体金稳定性的作用。2022-4-222 2、呈色性、呈色性 微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金（25nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（1020nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（3080nm）则是紫红色的2022-4-223 3、光吸收性、光吸收性 胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（max）在510550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，

3、大颗粒胶体金的max偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的max则偏于短波长。 胶体金的这一特性被用来检测所配制的胶体金溶液是否符合生产所需。实验生产需要的合格的胶体金溶液的最大吸收波长应在522528nm处，且检测最大吸光度处吸光值与456nm处吸光度值的比值，应在1.6-1.8之间。胶体金粒径（胶体金粒径（nm）1%柠檬酸三钠加入量（柠檬酸三钠加入量（ml）胶体金特性胶体金特性呈色max162.00橙色51824.51.50橙红522411.00红色52571.50.70紫色5352022-4-22三、免疫胶体金技术介绍1 1、免疫胶体金技术简介、免疫胶体金技术简介 免疫胶体金技术(Immune

4、 colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为：GICT。 胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。 根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生

5、物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。2022-4-222 2、免疫胶体金原理、免疫胶体金原理 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成

6、牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 2022-4-223、常用的免疫胶体金检测技术常用的免疫胶体金检测技术（1）免疫胶体金光镜染色法（2）斑点免疫金渗滤法（3）胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应

7、，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。2022-4-22四、PCT相关介绍1 1、PCTPCT简介简介PCT（降钙素原，procalcitonin）是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。血清降钙素(CT)的前肽物质分子量：14.5 kDa由116个氨基酸组成的糖蛋白质

8、无激素活性2022-4-222 2、PCTPCT的指征的指征 PCT是诊断和监测细菌炎性疾病感染的一个参数。 PCT的测定可以预示为：作为一个急性的参数来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。 监测有感染危险的患者（如外科术后和器官移植后免疫抑制期，多处创伤后）以及需要重症监护患者，用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。2022-4-22正常情况CT CT 降钙素降钙素脓毒血症及促炎症细胞因子PCTPCT降钙素原降钙素原2022-4-22脓毒症诊断的生物标志物An Informal Categorization of Biomarkers of Sepsis Marker Diagnos

9、is Prognosis Monitoring Procalcitonin Interleukin 6 White cell count Endotoxin C-reactive protein HLA-DR Protein C IL-10 HMG-1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 无论是对脓毒症的诊断、预后评估及治疗监测，PCT都体现出最优异的性能2022-4-223 3、PCTPCT在临床中的意义在临床中的意义PCT反应疾病的严重程度随着疾病的进展水平持续升高在感染疾病严重程度的发展过程中，PCT随着严重程度的不

10、同（局部感染、脓毒血症、严重脓毒血症、脓毒性休克），呈现由低到高的浓度变化。2022-4-22五、PCT胶体金试纸制备1 1、胶体金制备原理（、胶体金制备原理（氯金酸法） 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。HAuCl4 还原剂Au原子2022-4-22试剂和浓度试剂和浓度还原剂还原剂形成胶体金的大小形成胶体金的大小1%氯金酸水溶液白磷的二乙醚溶液5nm颗粒，红色溶胶1%氯金酸水溶液抗坏血酸水溶液12nm颗粒，红色溶胶1%氯金酸水溶液柠檬酸三钠水溶液15150nm颗粒，红色溶胶不同还原剂产生的胶体

11、金这里主要谈谈制备2040nm金颗粒，因为这种大小的金粒最适于快速诊断测试使用。2022-4-22配置样品垫处理液配置金标垫处理液配置胶体金粘膜配置划膜液样品垫处理切割喷金内包大卡组装金标垫处理标记抗体划膜外包入库现场抽检取样送检2022-4-222 2、配液前的准备工作以及注意事项、配液前的准备工作以及注意事项（1）由于氯金酸对金属的强腐蚀性，因此，一切接触氯金酸的物体都应该为非金属材质。包括：称量匙，以及配置胶体金时，磁力搅拌器上的温度传感器，以及ph计上的温度传感器。（2）所使用的玻璃器皿必须是清洗干净，并且经过重铬酸钾和硫酸浸泡过的。浸泡前用超纯水清洗干净，用毛刷刷干净，干燥后用重铬酸

12、钾和硫酸溶液浸泡24 小时以上，用清水冲洗3-4次，干燥待用。此种方法可以不需要硅化处理。如若玻璃器皿不干净（有其他金属离子存在或者灰尘）都将会影响金颗粒的形成，以及大小不均匀或者浑浊。2022-4-22（3）由于氯金酸的对光敏感性，因此配制胶体金的整个过程都需要避光，或者弱光，避免使用日光灯等照明设施。氯金酸长时间储存在光下容易变成黑色，影响结果的观察。（4）氯金酸吸湿性极强，因此综合考虑，为了减少称量误差等因素，称量时，天平室将抽湿机打开，使空气湿度降至30左右，同时采取减量法称量。一般情况下，拆开后尽量一次配置完。（5）配制好的1的氯金酸溶液储存在4冰箱里，黑色塑料袋封住避光。2022-

13、4-223 3、PCTPCT胶体金试纸样品垫处理液配置胶体金试纸样品垫处理液配置Borax4.44gCasein0.233gPvP-102.33g胆酸1.167gS-164.66gEDTA0.7g先用30% k2CO3 溶液将PH调节到9.0然后定容至233.3ml4保存，有效期两年注：Borax硼酸，Casein酪蛋白，PvP-10聚乙烯吡咯烷酮，S-16惰性蛋白，EDTA乙二胺四乙酸先将水加热至60 左右，依次加入S-16，搅拌溶解，冷却至室温，加入Borax 、PvP-10和胆酸，因为Casein和EDTA不是很稳定，需要最后加入。在未加入k2CO3碳酸钾调节PH前会有一些沉淀不溶解，P

14、H升高后会溶解，不需要奇怪。2022-4-224 4、PCTPCT胶体金试纸金标垫处理液配置胶体金试纸金标垫处理液配置Na2HPO48.83gBSA6.25gTriton-x1001.25gPVA6.25g先用1M的HCL调节PH至7.4然后加纯水定容至1250ml4保存，有效期两年注：BSA牛血清白蛋白，Triton-x100聚乙二醇辛基苯基醚，PVA聚乙烯醇先将水加热至60 左右，加入Na2HPO4和PVAPVA，冷却至室温，最后加入BSA和Triton-x100，搅拌溶解。 2022-4-225 5、PCTPCT胶体金试纸样品垫和金标垫处理胶体金试纸样品垫和金标垫处理 样品垫和金标垫的处

15、理方式一样，都是将切割好的样品垫（玻纤膜-有些脆，需小心）和金标垫（聚酯膜）浸泡在处理液中1小时，使其彻底湿润。（半小时需用镊子翻一次面） 然后将浸泡好的膜放入烘干机内37 烘干20小时（此时要记录浸泡的膜的张数，处理液的剩余量，干燥室内的温度和湿度），烘干后取出膜放入装有干燥剂的铝箔袋内备用，整个过程要在烘干箱内完成。2022-4-226 6、配置胶体金、配置胶体金准备的试剂准备的试剂：1% 氯金酸，1%柠檬酸三钠（现配现用），超纯水步骤：步骤：1、取100ml超纯水于磁力搅拌器上加热至80-90；2、加入2ml氯金酸溶液继续加热至沸腾（保持沸腾10s）（注意：当氯金酸溶液加入后不可以再用金

16、属温度传感器，以防止损坏传感器，污染溶液）；3、快速加入（取1%柠檬酸三钠溶液3ml，超纯水定容到10ml）上述烧瓶中，同时搅拌迅速，使其充分接触反应，继续加热，直至溶液沸腾，将加热温度降至105-110 （待确认）保持沸腾反应10min；4、停止加热，将烧瓶移至避光处，自然冷却至室温。（注意：整个过程都是避光的）2022-4-225、检测1：待胶体金溶液冷却至室温，肉眼观察胶体金溶液的颜色是不是酒红色，是否澄清，无漂浮物或者沉淀。 检测2：用分光光度计检测吸光度：检测最大吸光度值是否在525nm附近，方法是可以用光谱扫描法找到最大吸光度值波长，也可以用多波长测量法检测525nm及其附近波长的

17、吸光度，比较大小。最大吸光度值在525nm+3nm处为合格. 检测3：检测最大吸光度处吸光值与456nm处吸光度值的比值，是否在1.6-1.8之间。2022-4-22影响胶体金稳定的因素：影响胶体金稳定的因素：1、操作环境和所用容器的清洁度2、配制溶液所用的水（均需使用双蒸水或三蒸去离子水配制，烧制胶体金最好用去离子水）3、还原剂的使用量4、不同的烧制方法5、胶体金的制备量6、还原剂的加入方式7、加热容器的大小8、加热的时间2022-4-227 7、标记胶体金、标记胶体金1.取检验合格的胶体金溶液100ml,用碳酸钾（0.2mol）调节PH至7.2-7.4（大约400ul）（先用试纸测量，再用

18、酸度计测量）室温搅拌15min；2.加入1mg PCT鼠抗人单抗（使抗体终浓度为10ug/ml）,室温搅拌30min；3.加入2ml 10%BSA封闭抗体,室温搅拌30min；4.装入2罐离心管，812000rpm离心20min；5.弃上清液，留沉淀。2022-4-22蛋白通常带有多种电荷，当蛋白带正电时，能与胶体金所带的负电荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通过疏水作用将蛋白结合至金颗粒表面；有些蛋白则可通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共轭连接。2022-4-22pH等于或稍偏于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子于胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微

19、弱的水化状态，轻易吸附于金颗粒表明在低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合胶体金溶液PH与蛋白质结合金颗粒的关系2022-4-228 8、标记胶体金复溶标记胶体金复溶取1.5ml金标复溶液溶解沉淀，使终浓度浓缩50倍（100ml胶体金溶液），加入固体蔗糖0.1g（根据实际的残留沉淀量来定，m=残留沉淀V*0.2）,使终浓度达20%。溶解混匀（总体积2ml,4保存）。胶体金复溶液配置胶体金复溶液配置100mlTris0.243gBSA1.0g蔗糖20g海藻糖5gNaN3 0

20、.10.05g调节PH至8.0，定容至100ml4 保存，有效期7天注： NaN3是剧毒化学品，取用需谨慎小心。2022-4-229 9、喷金、喷金1、清洗喷金泵，清洗结束，排空清洗液，调整喷笔位置，若溶液量较多时可以循环溶液，放慢循环速度，使其中不残留气泡，否则影响局部喷量，使批内差增大，甚至不合格。2、若溶液量较少时采取倒吸的方式，倒吸时使速度慢，防止气泡进入，影响喷量。3、根据金标垫的切割宽度为6mm,所以每条喷量宽度应不大于6mm，根据1.7ul/cm的喷量，保证均匀性，同时调整喷条中线的距离，方便切割。（金标垫大规格84*300mm，可以喷金七条）4、喷金结束要将喷条干燥15-17h

21、,密封保存。同时清洗泵和喷笔，使泵中留有清洗液，便于浸泡。2022-4-221010、粘膜、粘膜将25mm宽的NC膜粘在PVC底板上，注意粘膜时，粘膜位置是否对齐。NC膜是否干净，无毛刺，无霉变2022-4-221111、配置划膜工作液、配置划膜工作液1、3%海藻糖溶液的配制：用已配好的PBS溶液做溶剂，配制3%海藻糖溶液（现配现用）。例：5mlPBS做溶剂，加入0.1499g海藻糖配置成3%海藻糖溶液，用玻璃棒搅拌2、划膜工作液的配制：a:检测线-T线（鼠抗人单抗配制 1ml 0.7mg/ml）例： b:质控线-C线（羊抗鼠多抗配制 1ml 0.9mg/ml）例：2022-4-221212、

22、划膜、划膜1、清洗划膜泵，清空清洗液，循环或者倒吸划膜液，使不要有气泡；2、按照划膜机标准操作规程，以“252”泵速（对应速度1ul/cm），将质控线液和检测线液均匀地划在膜上，检测线划在距膜顶端15mm0.1mm处，质控线划在距膜顶端9mm0.1mm处，质控线与检测线相距6mm0.1mm。（NC膜靠近吸水纸一端为顶端）3、划膜后37度干燥17-20h，干燥后铝箔袋封存。注意点：划膜时注意两划膜线的距离是不是6mm，划膜是否有不均匀或者段线的地方。划膜量控制为1ul/cm。装袋要在干燥箱中进行。2022-4-221313、切割和组装、切割和组装1、各组分用切割机切割成以下大小： 金标垫：6mm

23、 300mm 样品垫：19mm300mm 吸水垫：17mm300mm2、组装大卡：金标垫1片，搭上NC膜3-4mm ； 样品垫1片，搭上金标垫2mm； 吸水纸1片，搭上NC膜2mm。2022-4-221414、切条、切条1、组装环境条件的控制在相对湿度30%以下，并所有组件拆封后暴露于空气中时间不超过2小时。2、按照切条工序作业指导书使用切条机，将组装好的降钙素原（PCT）检测试剂条切割成宽度为3.42mm0.1mm试条，切条过程中应于前、后及过程中每30分钟对切条的宽度检查一次。17mm19mm6mm10mm6mm9mm2022-4-221515、内包、内包1 1、检测卡的装配、检测卡的装配

24、（1）按照不同规格的要求，需要进行检测卡装配的试纸条先把切好的试纸条装配到完好的PVC卡中，再用压卡机进行压卡，装条时应注意检查条有无划痕污渍，宽度是否符合要求；（2）PVC卡外观应清洁，平整，无变形，底面配套性好，压卡应注意调节松紧度，避免将卡压破或变形。2 2、装袋、装袋将压好的检测卡装入铝箔袋中，一个铝箔袋中应有一个检测卡，一包干燥剂，一个滴管，印上生产批号，生产日期和有效期。2022-4-221616、外包、外包将内包好的铝箔袋装入包装盒中，封膜包装。2022-4-221717、入库、入库2022-4-221818、生产中的一些质控点、生产中的一些质控点1、NC膜检测：外观颜色：洁白，

25、光泽，膜表面，边缘 膜宽度：25+1mm 膜厚度：185+19um;235+40 跑水性能：4cm的时间有135s和90s，偏差为+-1s,国产120+-40s 蛋白承载量试验： 与pvc板的对比度试验：颜色2、定量产品抗体包被硝酸纤维素膜检测： 外观检查：平整、洁净、无破损 物理检查：c、t线 性能检查：质控品检查 批内差：1.7ng/ml检查2022-4-223、（现场抽检项）胶体金溶液检测：外观，最大吸收峰值，吸光度比值（最大吸收值与456nm处吸光度比值）4、（现场抽检项）标记胶体金溶液检测：物理检查，OD值5、（现场抽检项）喷金条检测 物理检查：表面干燥，颜色紫红色，均匀，金条之间无

26、融合现象，断点有标记6、（现场抽检项）划膜条检测 物理检查：表面干燥，颜色均匀，T、C线间距稳定在6mm，断点有标记7、（取样送检项）定量PCT大卡组装检测：外观，膜条宽度，液体移行速度，最低检测线，阴性特异性，阳性特异性，线性范围，准确度，批内差8、（取样送检项）半成品检测：不同规格的试剂制备完成后，以PCT质控品、PCT 阳性和阴性血清样本进行检测，观察试剂的性能。9、（取样送检项）定量PCT成品检测2022-4-221919、相关知识、相关知识1、膜的分类标准(m和s) m: 指的是膜孔径 换算情况大致为：8m=135s；6m=180s 2、不同秒数的膜对反应的影响 通过速度越快和包被在

27、T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。 135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法. NCNC（硝酸纤维）膜的选择（硝酸纤维）膜的选择2022-4-22胶体金免疫层析试纸模式胶体金免疫层析试纸模式1、双抗体夹心模式：疫病抗原检测判定检测线 质控线阳性显色显色阴性不显色显色2022-4-222、竞争模式：小分子物质检测判定检测线 质控线阳性不显色显色阴性显色显色2022-4-223、SPA/蛋白G模式：疫病抗体检测判

28、定检测线 质控线阳性显色显色阴性不显色显色2022-4-22胶体金调整正确的胶体金调整正确的pHpH值值 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1M K2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1M HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可。Frens标准方法：（1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL；（2）约过25s沸腾

29、的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色；（3）继续煮沸约5分钟后结束反应；（4）冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值；（5）此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。附注：有研究者已经注意到影响胶体金质量及其稳定性的几种因素，制备过程中器具若全部使用干净的玻璃器皿，溶液一律用0.2um滤膜过滤后使用，水用玻璃三蒸水，推荐使用超纯水，采取这些措施后制得的胶体金很稳定。这些措施表明即使很微量

30、的污物都会对胶体金制备带来不良影响。虽然经常可见推荐使用硅化玻璃器皿的说法，其实使用普通玻璃器皿同样也能制出高质量高稳定性的胶体金。2022-4-2230nm胶体金颗粒制备（参考彭伏虎胶体金试纸条检测H9亚型禽流感病毒的研究和胡仁建HPV型免疫胶体金诊断试纸条的制备）取0.01%HAuCl4溶液200ml倒入500mL平底烧瓶中，加热煮沸，快速加入3.6mL事先预热至37 的1%柠檬酸三钠溶液，再加热15min，自然冷却至室温并补水至200ml，用0.1mol/L的K2CO3溶液调PH至8.2.2022-4-222022-4-22待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb(单克隆抗体)时，调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA（蛋白A）时，调至5.96.2；标记ConA（刀豆蛋白）时，调至8.0；标记亲和素时，调至910THANKS2022-4-22THANKS