全基因组检测与遗传病筛查课件.pptx
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- 基因组 检测 遗传病 课件
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1、全基因组平台全基因组平台人类人类3.6万基因全部测出万基因全部测出不是人类疾病基因全部测出不是人类疾病基因全部测出l全基因组测序(HiSeq X10)是探索并掌握个人遗传组成的最有效手段,l检测DNA里包含的所有变异,包括发生在编码区的小范围突变,也包括用全外显子组测序等方法检测不到的某些重要的非编码区变异以及结构变异。l数据结果不太稳定,精度好l检测后不知所措:不知道该用什么措施去认识,分类和治疗l染色体全基因组芯片Chromosomal Microarray Analysis (CMA)l稳定的检测所有的染色体结构变异和部分已知突变l数据结果比较稳定,分辨率差l检测后有较成熟的软件分析和重
2、现性,有FDA批准人体遗传变异两种领域l种系变异生物界germline variantsl出现在各种罕见或常见的遗传疾病中l基因异常出现频率占总基因1/万l体细胞变异-肿瘤界somatic variantsl体细胞变异则是癌症和遗传病发生的主要原因l基因异常出现频率: 癌症基因占总基因1/100(300:30000); 遗传病基因占总基因3/万检测遗传学变异检测遗传学变异-两种主流技术平台两种主流技术平台l基因测序平台检测碱基突变l一代测序l二代高通量测序(产前项目 cFDA通过)l全基因组测序 都有仪器数据分析系统 但报告软件系统没有建立l染色体芯片分析-检测结构改变CNV(FDA通过)la
3、CGH 比较基因组杂交l全基因组CMA: aCGH+SNPl全基因组CytoScan HDl全基因组OncoScan 都有仪器数据分析系统 仪器外报告软件云服务已在建立全基因组测序:全基因组测序:HiSeq x 10-10台测序仪组和服务器台测序仪组和服务器GeneChip系统系统 :是由高密度GeneChip芯片和试剂,杂交、扫描仪器,数据处理和分析工具组成检测平台,世界上第一种经欧盟和美国FDA审批的体外诊断的芯片系统。片面:片面: 全基因组和高深度测序,才能真正解析基因变异对疾病的影响并全基因组和高深度测序,才能真正解析基因变异对疾病的影响并更好地开发靶向治疗药物,实现个体化医疗。更好地
4、开发靶向治疗药物,实现个体化医疗。l全基因组测序缺乏重复性lHiSeq X Ten是Illumina于2014年推出的最新测序系统,工厂规模的测序系统,实现了Illumina测序仪迄今为止最高的测序通量和最低的测序成本。HiSeq X Ten系统由10台超高通量测序仪HiSeq X组成,测序读长为2150bp,单台仪器每次运行可产出高达1.8Tb的数据,运行时间在三天以内,10台仪器同时运行时,每周至少可完成320个人类基因组测序(以30覆盖度计算),l千年基因的HiSeq X Ten测序实验在CLIA(Clinical Laboratory Improvement Amendments)及I
5、GN(Illumina Genome Network)认证的基因组学实验室开展,其中CLIA是国际公认的提供临床测序服务的最高认证,亚太区仅千年基因总部Macrogen及Takara Bio两个机构通过认证(药明康德仅PGM通过CLIA认证)l高通量测序缺乏稳定性lIllumina2011年推出MiSeq,实现1000bp读长,获得高通量最精确的测序,但是科研思维贻害公司(只有枪,至今未见生产子弹,需客户科研自造)lThermo-LifeTech 2010年推出PGM,以后推出PROTON,时间快,灵活应用于临床,有少数子弹供应(CancerPanel,inherit Panel,BRCA1/
6、2,传染病)l高通量测序都遇到政策阻碍,技术本身缺点 文库制作繁琐,质控难 没有规范测序深度, 多次PCR环节,不断放大系统内产物误差 软件自设计自主过滤导致不确定数据采集千年基因千年基因HiSeq X Ten测序结果展示测序结果展示注:注:医学临床要求长医学临床要求长read测序深度至少测序深度至少80X样本名称样本名称SampleR1 Q30 (%)91.0R2 Q30 (%)85.2Avg. Q30 (%)88.1read长度(bp)150总reads数目875,493,626总碱基数目(Mb)131,324平均测序深度(X)45.9参考基因组长度(Mb)2,858去除duplicate
7、后可比对reads数目733,598,826去除duplicate后可比对reads比例91.8%测序深度大于1X的参考基因组覆盖率99.3%测序深度大于5X的参考基因组覆盖率99.0%测序深度大于10X的参考基因组覆盖率98.5%为什莫目前高通量和全基因组测序还不稳定?为什莫目前高通量和全基因组测序还不稳定?lQ30每下降10%,数据过滤时将有约20%的reads被滤掉,意味着75%的Q30将比85%的Q30少20%的可用数据,而致病变异很可能也同时被过滤掉了,l边合成边测序时第二条read的碱基质量一般会低于第一条readl由于测序试剂、实验操作和GC bias等因素影响,所有待测区域的覆
8、盖深度并不完全一致。尤其是高GC含量的区域,由于测序偏好性的存在一般覆盖深度会低于其他区域。lPCR扩增不可避免引入的完全一致的DNA片段,duplicate reads所占比例的高低主要取决于实验人员操作的熟练程度。由于这部分数据对后期的变异分析没有意义,因此会在分析前过滤去除。Chromosomal Microarray Analysis (CMA) 平台分类平台分类 十余年来,生物界基因组引领十余年来,生物界基因组引领-从微观走向基因组从微观走向基因组l基于胚系突变的学科进展细胞分子生物学,分子遗传学,医学遗传学,基因组学,癌症基因组学(TCGA), 药物基因组学,转化医学,个体化靶向治
9、疗.l基于胚系突变的技术进步-核型分析,PCR技术,FISH, 定量PCR,SNP(GWAS),LOH, 片段分析,基因测序(一代,二代)全基因组芯片全基因组芯片从染色体宏观走向基因从染色体宏观走向基因微观改变微观改变l更适应解决体细胞个体化治疗分子病理技术lCNV,突变,突变,FISH, 表达谱,甲基化,微卫星表达谱,甲基化,微卫星-涵盖体细胞染色体病涵盖体细胞染色体病Mayo clinic pathologistDr. Pandita l新的认识:肿瘤启动突变来自于CNV (C class)和序列突变(M class)l实体瘤主要由CNV启动,不是突变l强调全基因组CNV分析在临床预测,预
10、报和诊断方面的重要性。l下一代测序技术目前对临床病理最常见的低丰度CNV,中心拷贝杂合子缺失nlLOH,纯合子缺失和亚克隆进展部分细胞形成少量的mosaic等检测能力不足ltumors can be classified in those driven by either mutations (M class) or copy number aberrations (C class). C class tumors noted that predictive copy number changes are more frequent than predictive somatic mutati
11、on changes in solid tumor samples. lThese results seem to indicate that there is some risk to limiting tumor profiling to somatic mutations, and emphasize the importance of whole genome copy number analysis in identifying clinically relevant prognostic and predictive markers.lNext generation sequenc
12、ing technologies have limited ability to detect clinically relevant lower level amplifications, copy neutral loss of heterozygosity, and homozygous deletions, even at significant depth of coverage. Copy Number Tumors Revealedl2 solid tumor classes- M class (mutation driven) and C class (copy number
13、driven)lNature Paper : Patients with CN versus SM1.Ovarian 100% CN, 0% SM2.Breast- 90% CN, 20% SM3.Lung SQ -85% CN, 25% SM4.Head & neck- 75% CN, 30% SM5.Lung ADC -60% CN, 40% SMlMultiple CN Are Druggable/Predictive By Currently available drugs染色体减数分裂随机导致疾病染色体减数分裂随机导致疾病1.5%,1/3流产流产l无着丝粒断片lcen 着丝粒lchi
14、 异源嵌合体lct 染色单体ldel 缺失lder 衍生染色体ldic 双着丝粒ldup 重复lend 内复制lg 裂隙lh 次缢痕li 等臂染色体lins 插入linv 倒位linv ins 倒位插入linv(p-q+) /inv(p+q-) 臂间倒位lmar 标记染色体lmat 来自母亲lmos 嵌合体(同源)lP 染色体短臂lpat 来自父亲lPh 费城染色体lq 染色体长臂lr 环状染色体lrcp 相互易位lrea 重排lrec 重组染色体lrob 罗伯逊易位ls 随体lsce 姐妹染色体互换lt 易位ltan 连续(串联)易位 染色体病图片lter 末端lpter 短臂末端lqter
15、 长臂末端ltri 三着丝粒医学遗传学医学遗传学平衡易位是发病基础平衡易位是发病基础l平衡易位:减数分裂时相互易位和复杂易位形成的原发性易位,基本上无遗传物质的丢失,对个体的发育一般无严重的影响,故称之为平衡易位平衡易位携带者通常不会患有异常表型,外貌、智力和发育等通常都是正常的。l l“平衡易位”在普通人群发生率为19%。,染色体平衡易位患者流产和生畸形儿的可能性极高,生出健康儿的比例不足三分之一。l核型分析,FISH是以往主要手段l当下,“分子倒置探针杂交或分子核型分析”肿瘤肿瘤体细胞体细胞全基因组芯片分析发现全基因组芯片分析发现l癌细胞:及其复杂的体细胞染色体病CNV,突变,rearea
16、gement,扩增,多体,非平衡易位,nl LOH,断裂,缺失,倒位,嵌合,微缺失,同源杂合子缺失,异源性杂合子缺失,卫星-中心粒多体,非同源末端连接l实体癌:除液态血液肿瘤外的所有癌,80%以上的临床基因异常是体细胞染色体病,随亚克隆演进,上皮间质转化,成为形态学去分化核异形病理常规诊断的基础个体化治疗分子病理学技术个体化治疗分子病理学技术ASCO 2014 FISH 902 篇篇分子遗传新突破分子遗传新突破CytoScan HD assayl属于全基因组荧光杂交+PCR+软件诊断l全基因组的分子遗传技术仪器自动化原位杂交l优势检测肿瘤体细胞复杂演进性900基因突变CNV现象和核型多倍体分析
17、,可与形态验证。l重复性,分辨率,精确性优于FISH,l全基因组价格优于各种二代测序,4天软件报告目前用Affymetrix芯片发表的科学文章现已多达143190篇(截至2014年5月29日),多篇文章发表在nature、science、cell等世界最高级别的学术刊物上 lSearch Results for complete copy numberlDisplaying records: 1 - 10 of 35lPermissions Request Form - The Hematologist4/17/2009 | The Hematologist. www.hematology.o
18、rg/publications/hematologist beforecompleting this form . We will return a signed copy of this form .Photocopy (complete Section 2 .l2013 American Society of Hematology / American Society of.6/10/2013 | ASH Website. 4 DEFINITIONS Cloning Cut & Paste = Blocks of text or evencomplete notes from anothe
19、r MD Copy & Paste = Carry forward of prior notes .lASSOCIATE MEMBERSHIP APPLICATION American Society .10/29/2013 | ASH Website. to ASH NewsLink Complimentary copy of Hematology . When submitting your completed application, make . weeks after yourcomplete application is .lBlood Basics3/29/2014 | ASH
20、WebsitelMultiple Myeloma: To T or Not to T, What Will the Answer Be?11/1/2011 | The HematologistASCT has been a standard of care in myeloma due to achievement of both high extent and frequency of response and to the prolonged progression-free survival compared with conventional chemotherapy. However
21、, the availability of novel therapies, including bortezomib and lenalidomide, that have improved outcome has impacted the transplant paradigm.lRights and Permissions4/11/2014 | The HematologistMaterial published in The Hematologist: ASH News and Reports is covered by copyright. All rights reserved.
22、The American Society of Hematology (ASH), the publisher of The Hematologist, expects that you will respect its intellectual property rights and use its material solely as permitted by Sections 107 or 108 of U.S. Copyright Law (Fair Use).lASH-AMFDP Award4/2/2014 | ASH Websitel美国Affymetrix 公司是基因芯片产业先行
23、者,早在1989年就研制出了世界首张基因芯片。其开发的寡核苷酸原位光刻合成专利技术(light-controlled in situ synthesis of DNA microarrays),是目前最高密度的芯片制备技术。Affymetrix 公司以其完备的芯片设计,稳定可靠的分析结果和强大的生物信息学分析能力,帮助研究人员在短时间内获得大量可靠的结果,为后续研究提供重要的线索和帮助。目前用Affymetrix芯片发表的科学文章现已多达24319篇(截至2011年12月29日),多篇文章发表在nature、science、cell等世界最高级别的学术刊物上。 lAffymetrix Gene
24、Chip生物芯片检测系统,是由高密度GeneChip芯片和试剂,杂交、扫描仪器,数据处理和分析工具组成的一整套检测平台,是世界上第一种经欧盟和美国FDA审批的可用作体外诊断的芯片系统。 l平台设备平台设备 Affymetrix GeneChip芯片系统的硬件平台由高度自动化的流体工作站、高通量芯片扫描仪,和相关探针序列描述和注释数据库等组成。高度自动化的处理减少手工操作时间,提高了数据重复性。配合使用不同类型的芯片,Affymetrix GeneChip芯片系统可用于RNA和DNA检测的多方面的应用研究。 l原位光刻合成技术原位光刻合成技术 Affymetrix芯片采用原位光刻技术和严格的流程
25、控制合成高密度基因芯片,可以在每平方厘米基片上合成超过400万的探针。Affymetrix原位光刻合成技术的原理:先将基片支持物(wafer)羟基化,并用对光敏感的保护基团将羟基基团保护起来。然后选取特制的光刻掩膜(photolithographic mask)覆盖在基片上,遮挡不需要合成的部位,暴露需合成部位。当光通过蔽光膜照射到基片上,需要合成探针的部位透光,受光照射部位的羟基脱保护而活化。加入3端活化(5羟基末端连接光敏保护基团)的单一一种核苷酸单体底物后,发生偶联反应。在一轮反应之后更换另一张光掩膜控制FISH技术与二代全基因组芯片比较看清片段大小能力-分辨率 FISH : Poor
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