引物设计一般原则课件.ppt
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- 引物 设计 一般 原则 课件
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1、引物设计的一般原则1.1.引物长度引物长度 7.发卡结构发卡结构2.2.GC% 8.二聚体二聚体3.3.Tm值值 9.错配错配4.4.3端碱基要求端碱基要求 10.交叉二聚体交叉二聚体5.5.5端碱基要求端碱基要求 11.产物长度产物长度6.6.G 值值 12.评分评分引物长度引物长度引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-24 bp,但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大于16bp是必要的(不容易引起错配)。例如:一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的
2、退火位点只有1/400个.较长的引物(28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点GC% 引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值值Tm DNA溶解温度,即DNA的双链失去一半时的温度。Tm 值计算的经验公式Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 退火温度一般低于Tm,退火温度越高,特异性越高,但杂交率越低。PCR退火温度一般是55,变性温度94, Tm一般在58-70之间比较合适。两个引物之间的Tm值应尽可能接近,不应超过43端碱基要求端碱基要求引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成
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