抗体的表达原理课件.ppt

1、第七章 抗体的表达华南农业大学食品学院廖振林提要 基因工程抗体巴在多种体系获得成功表达，包括哺乳动物细胞、大肠杆茵、酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物以及转基出动物等表达体系。其中哺乳动物细胞最接近抗体产生的天然宿主，是比较成熟、应用最多的表达体系，主要用于表达完整抗体分子，目前治疗性单抗的生产基本都用这一表达体系。通过对友达载体、宿主细胞及各环节的改良和完善，己可达到100mgL左右的表达水平，大肠杆菌体系不能对表达产物进行糖基化，只能表达抗体分子片段，但由于其遗传背景清楚，操作简单，成本低，周期短等优点，亦有较广泛的应用，尤其在研究领域。 酵母细胞和昆虫细胞表达体系具有一定的糖基化功能，能表达

2、完整抗体分子，可达到较高表达量 ，其操作及成本较哺乳动物细脑有一定优势，但在抗体表达中的应用尚不多，应用价值有待评价。转基因植物和转基因动物表达体系主要用于工程抗体的大规模生产，其成功应用尚需时日。抗体载体体统的种类 1 哺乳动物表达载体系统 2 大肠杆菌表达系统 3 酵母及昆虫细胞表达系统 4 动植物表达系统第一节 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞是最早用来表达抗体分子的，也是目前应用最多的表达体系。哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确立体空间构象所必需的分子伴侣，其内质网为抗体分子的正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化-还原环境。 此外哺乳类动物细胞还拥有完整的转录、翻译后加工及

3、分泌等机制，包括抗体的糖基化、羧基化等一系列复杂的加工过程，因而哺乳动物细胞表达系统表达的抗体通常具有正确的折叠和空间构象以及正确的装配，具有良好生物活性，基本近似于天然抗体。 同时哺乳动物细胞还能实现抗体的分泌性表达，表达产物可分泌至无血清或无蛋白的培养上清中，为抗体的分离纯化提供了最大的便利。此外表达抗体的哺乳动物细胞也能进行规模化培养，为抗体的产业化相应用奠定了基础。哺乳动物表达细胞 但哺乳动物细胞表达体系存在构建周期长、操作烦琐，表达产量相对低，生产成本较高等缺点。因此、尽管哺乳功物细胞表达体系能用于各种基因工程抗体的表达但最适合表达的还是全分子抗体以及某些不适宜在非哺乳动物细胞表达的

4、小分子抗体。哺乳动物细胞表达体系包括宿主细胞和表达载体：目前常用的宿主细胞主要有两类，一类是淋巴类细胞，另一类是非淋巴类细胞。一、淋巴类细胞 在体内抗体是由浆细胞分泌产生的，浆细胞具有抗体正确折叠，空间构象形成，链内及链间二硫键形成的内环境，包括内质网及参与此过程的各种协向因子和分子伴侣(加重链结合蛋白BiP GRP78，二硫化异构酶等等)，而且还合完成抗体恒定区糖基化等翻译后加工修饰的细胞器、蛋白及代谢产物；因此浆细胞应是最适合表达重组抗体的。但浆细胞不能在体外长期培养，永生化或恶性转化的浆细胞瘤和骨髓瘤细胞系对于表达重组抗体是最接近浆细胞的，这些细胞同浆细胞一样能提供抗体表达所需的全套协同

5、因子、分子伴侣以及糖基化等加工机制。 因此能用于表达各种重组的基因工程抗体。但是有的骨髓瘤细胞系本身也产生免疫球蛋白链，大多为轻链，选择时应首先考虑用那些本身不产生免疫球蛋白肽链的骨髓瘤细胞系。 由于目前尚无稳定但自身不分泌Ig的人骨髓瘤细胞系，因此，用于表达基因工程抗体的淋巴类细胞，主要是小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞。 目前在表达基因工程抗体最多的骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0和NSO，以及大鼠的骨髓瘤细胞YB2/0。这些骨髓瘤细胞均不产生和分泌任何免疫球蛋白。 SP2/0细胞系是小鼠骨髓细胞p3x63Ag8与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞融合而成的杂交瘤，再经培养和药物筛选发生变异后获

6、得的细胞系。 SP2/0是在表达基因工程抗体中用得最广泛的淋巴类细胞，尤其在人鼠嵌合抗体的表达中用得最多，仅其表达产量通常较低，多用于实验研究。 NSO细胞系是能在胞内合成轻链的NS1细胞的变异株，不再产生任何免疫球蛋白链，能用于表达各种全分子抗体，用该细胞系表达的抗人EGF受体的人源化改型抗体己在三期临床试用中。 此外，也有用小鼠骨髓瘤P3UI细胞表达人鼠嵌合抗体。用于表达重组抗体的大鼠骨髓瘤细胞仅见有YB2/0细胞的报道，该细胞系是大鼠骨髓瘤细胞Y3与A0株大鼠脾细胞融合建立的，本身也不表达任何免疫球蛋白肽链。用骨髓瘤表达重组抗体时，所用的表达载体通常多选用免疫球蛋白的启动子和增强子，因这

7、些细胞中含有它们所需要的转录因子，有利抗体的高表达。二、非淋巴类细胞 多种非淋巴类细胞都已被用于表达重组抗体，其中包括中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、猴肾来源的COS细胞、神经胶质瘤细胞、嗜伤细胞、Hela细胞、BHK细胞等等这些不同组织来源的不同类型的细胞，在蛋白质的糖基化中可能会有所差别，但到目前为止，尚未发现从这些非淋巴类细胞中表达的重组抗体有功能性的缺陷。非淋巴类细胞在表达重组抗体时若使用免疫球蛋自自身的转录调控元件，如启动子、增强子等，其表达效率低、出此常采用其他较强的启动子，如SV40早期基因和晚期基因启动子(Psv40-EL),CHO 人巨

8、细胞病毒立早基因启动子(PhCMV- IE)，病毒长末端重复序列LTR等等。通常非淋巴细胞表达重组抗体的产量低于淋巴类细胞，大多数在lugml以下。但近十余年的研究表明，通过一系列现代分子生物学技术，尤其是高效扩增表达技术，可使重组抗体在CHO细胞中的表达产量达200ug/ml。 此外，CHO细胞遗传背景清楚；转染效率高；能适用于多种载体；能表达各种类型的重组抗体；可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体；可用无血清或无蛋白培养基培养，有利于抗体的纯化；能进行大规模培养。因而CHO细胞已成为生物技术产业化培养的首选工程细胞系， 目前已批准上市的基因工程抗体几乎都是在CHO细胞中表达的。COS 另

9、一种常用于表达重组抗体的非淋巴类细胞是COS细胞，COS细胞是用sv40病毒的大T抗原转染猴肾细胞获得的一株能长期传代的细胞系，含有SV40复制子的重组表达质粒转染COS细胞后，其重组DNA并不整合到细胞的染色体上、而是以游离的形式存在于细胞浆内、并迅速大量复制达到很高的拷贝数； COS细胞也具有糖基化和装P配分泌抗体的功能。 因此表达的各种抗体具有抗体的功能活性：由于转染的外源DNA在COS细胞并不整合，而是以游离形式存在并复制，因此COS细胞最常用于抗体的瞬时表达。近年来COS细胞己用于筛选或检测新构建的新型抗体的活性及特征，也用于研究从噬菌体库中筛选的抗体基因在真核细胞中表达的功能和特点

10、，还用于各种抗体突变体的筛选。而且，结构更为复杂的双特异性抗体也在COS细胞表达成功。 如抗人OKT3/转铁蛋白受体的双特异抗体在COS细胞成功表达，其产量和活性均优于在大肠杆菌中的表达。 三、抗体的高效表达 治疗用基因工程抗体的临床用药量大，还远超过其它生物制品。以美国批准上市的治疗肿瘤的两种人源化抗体Rituxan和Herceptin为例 ， Rituxan 一个疗程约需用药1.2g， Herceptin一个疗程约需用药0.88g，而正在临床试用的抗VEGF人源化抗体，一个病人的最大用药量甚至达到了7.8g，这些抗体类生物制品比细胞因子类生物制品用药量高出几万倍。因而基因工程抗体的高效表达

11、已经成为其临床应用的最重要的先决条件之一，甚至已影响到基因工程抗体的研究开发。目前已上市的以及正处于临床试用中的基因工程抗体多达上百种，其中绝大多数那是在哺乳动物细胞中表达的，更确切地说，是在CHO细胞中表达的。以下将简要地叙述抗体在哺乳动物细胞高效表达所涉及的诸多要素(见表7-1)。抗体表达的策略 抗体在哺乳动物细胞中表达的过程是抗体的重组表达载体与宿主细胞之间相互作用的一个复杂过程，包括5个相对独立的环节： 抗体基因在宿主细胞染色体上的定位，主要是指抗体基因在染色体上的整合位点以及抗体基因的基因剂量。 抗体mRNA的转录，转录效率与mRNA的稳定性是其中最重要的因素。 抗体基因的翻译。 抗

12、体的翻译后加工、组装。 抗体的分泌；针对以上5个环节，设计相应的措施提高各环节的效率，有助于提高基因工程抗体在哺乳动物细胞中的表达水平。此外还有一些实际操作因素的影响，如高表达细胞株的筛选，生产细胞的稳定等等。（一）哺乳动物细胞表达抗体的载体系统（一）哺乳动物细胞表达抗体的载体系统 基因工程抗体的表达载体系统是获得高表达基因工程抗体的表达载体系统是获得高表达抗体细胞株的关键，在确定宿主细胞后，基抗体细胞株的关键，在确定宿主细胞后，基 因工程抗体的表达产量很大程度上由共表达载体因工程抗体的表达产量很大程度上由共表达载体的各表达调控元件及组织方式决定。的各表达调控元件及组织方式决定。 一般来说，一

13、般来说，表达载体含有以下几种基本元件：骨架序列、选表达载体含有以下几种基本元件：骨架序列、选择标志基因、表达盒以及一些特殊的调控序列。择标志基因、表达盒以及一些特殊的调控序列。除骨架序列外，其它元件对抗体的高效表达均存除骨架序列外，其它元件对抗体的高效表达均存在一定的影响。在一定的影响。载体系统分类载体系统分类 根据工程细胞克隆中目的基因拷贝数能否根据工程细胞克隆中目的基因拷贝数能否扩增，表达载体可分为两类：扩增，表达载体可分为两类： A 可扩增表达载体系统。可扩增表达载体系统。 B 不可扩增表达的载体系统。不可扩增表达的载体系统。 有一类特殊的选择标志基因可以在外有一类特殊的选择标志基因可以

14、在外界逐渐增高的选择压力下实现在宿主细胞界逐渐增高的选择压力下实现在宿主细胞染色体上的基因拷贝数的扩增，并且可以染色体上的基因拷贝数的扩增，并且可以连带两侧的序列一同扩增，从而提高产量。连带两侧的序列一同扩增，从而提高产量。二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶(DHFR) 目前报道的基因工程抗体的高效表达载体系统目前报道的基因工程抗体的高效表达载体系统无一例外地采用了可扩增表达的载体。上述的可无一例外地采用了可扩增表达的载体。上述的可扩增选择标志基因目前主要包括有二氢叶酸还原扩增选择标志基因目前主要包括有二氢叶酸还原酶酶(dhfr)基因和谷氨酰胺合成酶基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因，其中基因，其中使

15、用最久、最广泛、效果最好的使用最久、最广泛、效果最好的dhfr基因。基因。 dhfr基因编码的基因编码的DHFR是细胞代谢途径中的是细胞代谢途径中的一个重要的酶当细胞缺乏此酶或此酶失活一个重要的酶当细胞缺乏此酶或此酶失活 时必须依靠在培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶时必须依靠在培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核核苷才能存活。脱氧核核苷才能存活。 甲氨蝶呤甲氨蝶呤(MTX)是是 DHFR的类似底的类似底物可竞争抑制物可竞争抑制DHFR的活性。当环境的活性。当环境存在高浓度的存在高浓度的MTX，dhfr基因可自发在基因可自发在染色体上扩增共拷贝数，以产生更多的染色体上扩增共拷贝数，以产生更多的DH

16、FR来维持细胞的正常代谢，当其扩来维持细胞的正常代谢，当其扩增时，可以连带它两侧的序列一起扩增，增时，可以连带它两侧的序列一起扩增，dhfr基因共扩增的序列的大小通常比该基因共扩增的序列的大小通常比该基因要大许多，甚至可以达到上千个基因要大许多，甚至可以达到上千个kb，足以包含其两翼的目的抗体基因，这种足以包含其两翼的目的抗体基因，这种共扩增也就实现了目的抗体基因的基因共扩增也就实现了目的抗体基因的基因剂量的扩增，从而极大地提高表达产量。剂量的扩增，从而极大地提高表达产量。 dhfr基因在基因在CHO细胞中扩增时能在染色细胞中扩增时能在染色体上形成较稳定的多拷贝序列，存在于宿体上形成较稳定的多

17、拷贝序列，存在于宿主细胞染色体中。因此选择可扩增表达系主细胞染色体中。因此选择可扩增表达系统时最好选择在统时最好选择在CHO细胞中表达，另细胞中表达，另外内源性外内源性dhfr基因的存在会降低外源性基因的存在会降低外源性dhfr基因带动扩增目的基因的效果。因此基因带动扩增目的基因的效果。因此应该选择应该选择dhfr基因缺陷的基因缺陷的CHO-dhfr -细胞，细胞，以达到抗体的最高表达。以达到抗体的最高表达。谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶(GS) 利用利用GS基因也可对目的基因进行扩增；基因也可对目的基因进行扩增；GS基基因是一种显性基因扩增选择标志基因，在染色体因是一种显性基因扩增选择标志基因

18、，在染色体上可以有较高的扩增倍数，像上可以有较高的扩增倍数，像dhfr基因一样，扩基因一样，扩增时连带两侧序列一起扩增。在外界存在蛋氨酸增时连带两侧序列一起扩增。在外界存在蛋氨酸磺酰胺磺酰胺(MSX)时。不表达或弱表达时。不表达或弱表达GS基因的细胞基因的细胞受到受到MSX的显性筛选死亡，而的显性筛选死亡，而GS基因表达较高基因表达较高的细胞则能存活。细胞对的细胞则能存活。细胞对MSX的耐受浓度与的耐受浓度与GS基因的表达水平呈剂量依赖关系，提高基因的表达水平呈剂量依赖关系，提高MSX的浓的浓度将要求细胞有更高水平的基因表达造成度将要求细胞有更高水平的基因表达造成GS基基因和目的基因的扩增，达

19、到目的基因的高表达。因和目的基因的扩增，达到目的基因的高表达。表达载体的表达盒表达载体的表达盒 每一个表达载体均带有目的基因的表达盒，每一个表达载体均带有目的基因的表达盒，表达盒一般包括表达盒一般包括启动子、克隆位点以及转录终止启动子、克隆位点以及转录终止信号。信号。 因为抗体分泌前导肽通常适用于多种抗体基因为抗体分泌前导肽通常适用于多种抗体基因，所以还可以将抗体分泌前导肽也包因，所以还可以将抗体分泌前导肽也包 含在表达盒中。另外，还可以在抗体分泌前导肽含在表达盒中。另外，还可以在抗体分泌前导肽前再加上一些特殊的表达调控序列。抗体基前再加上一些特殊的表达调控序列。抗体基 因表达盒的组织形式己较

20、为固定，但其中各元件因表达盒的组织形式己较为固定，但其中各元件的选择仍然有值得探讨的地方。的选择仍然有值得探讨的地方。 1 启动子 抗体基因表达盒中最关键的元件是驱动抗抗体基因表达盒中最关键的元件是驱动抗体基因表达的启动子以及相应的增强子。所有体基因表达的启动子以及相应的增强子。所有的真核启动子都含有两个基本组成部分，的真核启动子都含有两个基本组成部分，TATA盒和其下游的富含盒和其下游的富含GC的序列，的序列，TATA盒盒确定了转录起始位点，富含确定了转录起始位点，富含GC的序列则决定的序列则决定转录起始频率，因而不同的启动子产生不同的转录起始频率，因而不同的启动子产生不同的转录起始频率。转

21、录起始频率。 目前使用的哺乳类细胞表达系统的启动于目前使用的哺乳类细胞表达系统的启动于主要有病毒启动子，如主要有病毒启动子，如SV40早期基因早期基因 和晚期和晚期基因的启动子、人巨细胞病毒立早基因启动子、基因的启动子、人巨细胞病毒立早基因启动子、病毒的长末端重复序列病毒的长末端重复序列(LTR)等；哺乳类动物等；哺乳类动物细胞基因的启动子，如转录因于细胞基因的启动子，如转录因于EF-1的启动的启动子、人干扰素子、人干扰素-的启动子、各种鼠的启动子、各种鼠IgG启动子启动子等。等。2 核糖体进入位点 启动子下游有真核的核糖体进入位点，它对于启动子下游有真核的核糖体进入位点，它对于所有的抗体基因

22、的表达都是必要的。真核的核糖体进所有的抗体基因的表达都是必要的。真核的核糖体进入位点通常为入位点通常为GCCGCC A/GCCAUGG+4的共有序列，的共有序列，它通过调控核糖体进入它通过调控核糖体进入mRNA起始翻译的频率来影响起始翻译的频率来影响目的基因的翻译效率，从而影响目的基因的表达水平。目的基因的翻译效率，从而影响目的基因的表达水平。通常载体均带有核糖体进入位点，但其起始翻译的效通常载体均带有核糖体进入位点，但其起始翻译的效率并不太高。前面提到的率并不太高。前面提到的IRES具有较强的起始翻译具有较强的起始翻译的能力。最近的一些研究发现在某些哺乳动物细胞的的能力。最近的一些研究发现在

23、某些哺乳动物细胞的基因前，存在某些类似基因前，存在某些类似IRES的序列、可以独立启动的序列、可以独立启动翻译，并且产生的翻译效率很高，可以称之为翻译型翻译，并且产生的翻译效率很高，可以称之为翻译型增强子。增强子。3 转录终止信号和转录终止信号和polyA加尾信加尾信号号 载体的转录终止信号和多聚腺苷酸载体的转录终止信号和多聚腺苷酸(PolyA)加尾信加尾信号也在很大程度上影响抗体基因的表达。转录的终止号也在很大程度上影响抗体基因的表达。转录的终止和和polyA尾巴的合成影响尾巴的合成影响mRNA的有效合成和稳定性。的有效合成和稳定性。强转录终止信号和加尾信号可提高胞浆中能进行有效强转录终止信

24、号和加尾信号可提高胞浆中能进行有效翻译的翻译的mRNA浓度，提高表达水平浓度，提高表达水平 。目前使用最广泛。目前使用最广泛的是牛生长激素的转录终止信号和加尾信号的是牛生长激素的转录终止信号和加尾信号(BGH poly A site)，它的转录终止作用强于，它的转录终止作用强于SV40的。虽然的。虽然它也能有效地终止转录，并在以前被广泛采用，但最它也能有效地终止转录，并在以前被广泛采用，但最近的高效表达载体已极少采用。近的高效表达载体已极少采用。 另外的此转录终止信号和加尾信号也有被采用的，另外的此转录终止信号和加尾信号也有被采用的，如人如人-actin的的polyA和抗体本身的和抗体本身的p

25、oly A site，均获，均获得满意的效果。另外，将两个转录终止信号和加尾信得满意的效果。另外，将两个转录终止信号和加尾信号串联使用也可能增强终止转录的强度，例如同时利号串联使用也可能增强终止转录的强度，例如同时利用抗体恒定区基出组序列的转录终止信号和加尾信号用抗体恒定区基出组序列的转录终止信号和加尾信号以从载体上具有的以从载体上具有的BGH polyA信号。信号。(二)抗体高效表达的其他因素 1 抗体基因的结构抗体基因的结构 2 抗体表达克隆的筛选抗体表达克隆的筛选 3 宿主细胞的选择和筛选宿主细胞的选择和筛选有内部核糖体进入位点 invitrogenQiagene第二节 大肠杆菌表达系统

26、 一一 大肠杆菌表达系统的特点大肠杆菌表达系统的特点 是应用最广的源和表达系统，是应用最广的源和表达系统， 产量高产量高 ， 成本低成本低 ， 周期短等特点。周期短等特点。以下简述原核表达载体的构成元件及特点以下简述原核表达载体的构成元件及特点表达策略 一、基因表达信号一、基因表达信号如果将外源基因插入标准的克隆载体，不可能合如果将外源基因插入标准的克隆载体，不可能合成重组蛋白，因为基因的表达依赖于基因周围的一组成重组蛋白，因为基因的表达依赖于基因周围的一组信号，这些信号必须能被细菌识别。这些信号都是一信号，这些信号必须能被细菌识别。这些信号都是一些短的核苷酸序列，为转录和翻译提供信号，三个最

27、些短的核苷酸序列，为转录和翻译提供信号，三个最重要的信号：重要的信号：1） promoter: 是转录起始信号，在是转录起始信号，在E. coli中，中，启动子必须能被启动子必须能被RNA聚合酶的聚合酶的sigma亚基所识别。亚基所识别。2） Terminator：转录结束的位点，终止子一般：转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成是可以自我配对形成stem-loop的核苷酸序列。的核苷酸序列。3） 核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，转录成转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。分子后，核糖体在这一位点上结合。高等生物的基因也被表达信号所包围

28、，但他们的高等生物的基因也被表达信号所包围，但他们的核苷酸序列与核苷酸序列与E. coli的并不相同。比较的并不相同。比较E. coli和人类和人类的启动子，有一些是相同的，但是的启动子，有一些是相同的，但是E. coli的的RNA聚合聚合酶不可能结合到人类的启动子上，细菌不能识别人类酶不可能结合到人类的启动子上，细菌不能识别人类基因的表达信号。基因的表达信号。 解决的方法是将外源基因插入载体中，使解决的方法是将外源基因插入载体中，使其处于一系列的其处于一系列的E. coli表达信号的控制之下。表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。克隆载体提供了表这样基因可以转录和表达。克隆载体提供了表

29、达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体。为表达载体。 （一）（一） 启动子启动子启动子是表达载体的最重要的组成成分，启动子是表达载体的最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了决定了mRNA合成的速度。获得重组蛋白的数合成的速度。获得重组蛋白的数量很大程度上取决于表达载体所携带的启动量很大程度上取决于表达载体所携带的启动子。子。 所有所有E. coli启动子都有两个保守序列，保启动子都有两个保守序列，保守序列的变化是影响转录效率的主要因素。强守序列的变化是影响转录效率的主要因素

30、。强启动子可以启动高效率的表达，合成大量表达启动子可以启动高效率的表达，合成大量表达产物。相反，弱启动子，在细胞中表达量较低。产物。相反，弱启动子，在细胞中表达量较低。表达载体应该含有强启动子，这样克隆的基因表达载体应该含有强启动子，这样克隆的基因可以以最高的速度表达。可以以最高的速度表达。建立表达载体的另一个需要考虑的因素是建立表达载体的另一个需要考虑的因素是启动子的调控，主要有两种调控方式：启动子的调控，主要有两种调控方式：诱导：一个诱导的基因是在加入底物后基诱导：一个诱导的基因是在加入底物后基因的表达才能启动因的表达才能启动抑制：可抑制的基因是在加入调控物后表抑制：可抑制的基因是在加入调

31、控物后表达被关闭。达被关闭。a) 启动子的选择真核原核启动子差异 基因调控是一个复杂的过程，启动子的参与仅仅基因调控是一个复杂的过程，启动子的参与仅仅是间接的。许多参与诱导和抑制的序列存在于启是间接的。许多参与诱导和抑制的序列存在于启动子的周围。所以诱导和抑制启动子的化学试剂动子的周围。所以诱导和抑制启动子的化学试剂也同样调控克隆基因的表达。也同样调控克隆基因的表达。如果重组蛋白对细菌有害，其合成必须严格如果重组蛋白对细菌有害，其合成必须严格控制在毒性的水平之下。可以利用调控物抑制基控制在毒性的水平之下。可以利用调控物抑制基因的表达。即使重组蛋白对寄主细胞无害，仍然因的表达。即使重组蛋白对寄主

32、细胞无害，仍然需要调控克隆基因的表达，因为持续的高水平表需要调控克隆基因的表达，因为持续的高水平表达可以影响重组质粒的复制，最终导致表达产物达可以影响重组质粒的复制，最终导致表达产物的下降。的下降。b) 表达载体应用的启动子 几种使用频率最高的启动子：几种使用频率最高的启动子：1) lac启动子：控制编码启动子：控制编码-乳糖苷酶的乳糖苷酶的lacZ基因基因转录的序列，可以被转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物后，所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。可以诱导启动子下游的外源基因的表达。2) trp启动子：色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，启动子：色氨酸启动子可

33、以被色氨酸抑制，也可以很容易的被也可以很容易的被3-吲哚丙烯酸诱导。吲哚丙烯酸诱导。3) tac启动子：是启动子：是lac和和trp启动子的杂交分子，启动子的杂交分子，比两者都要强，同样可以被比两者都要强，同样可以被IPTG所诱导。所诱导。4) PL启动子：是负责启动子：是负责 DNA分子转录的启动分子转录的启动子之一。子之一。PL启动子是可以被启动子是可以被E. coli RNA聚合酶所识聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体别的强启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可以。该启动子可以被被cI基因产物所抑制。携带基因产物所抑制。携带PL启动子的载体使用温启动子的载体使用温度敏感的度敏感的E

34、. coli cI突变体。在较低的温度下，突变体突变体。在较低的温度下，突变体所产生的所产生的cI蛋白可以抑制蛋白可以抑制 PL启动子，在较高的温度启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。启动子下游的SD序列 启动子下游需有启动子下游需有SD(Shine and Dalgarno)序列，序列，这段序列是核糖体结合位点这段序列是核糖体结合位点(RBS)的一部分研的一部分研究发现究发现SD序列为序列为UAAGGAGG时比时比AAGGA翻译翻译效率高，起始密码子效率高，起始密码子ATG与与SD序列序列UAAGGAGG的最适距离为的最适距离为6-8b

35、P，与，与A AGGA的距离的距离5-7bP为为好，在分泌表达时需要有前导序列，大肠杆菌中好，在分泌表达时需要有前导序列，大肠杆菌中比较常用的几种前导肽序列为比较常用的几种前导肽序列为pelB(果胶酶基因果胶酶基因)、OmpA(外膜蛋白基因外膜蛋白基因)、OmpF等等 ，使用何种前，使用何种前导肽对产量影响并不大。导肽对产量影响并不大。解释SD序列 SD序列（序列（Shine-Dalgarno sequence）：）：mRNA中用中用于结合原核生物核糖体的序列。于结合原核生物核糖体的序列。 原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而序列引导从而识别识别

36、AUG起始密码。这段位于起始密码。这段位于AUG上游的序列和上游的序列和30S核核糖体亚基的糖体亚基的16s rRNA一段序列互补，保守区一段序列互补，保守区5-UAAGGAGGUGA-3，核糖体结合位点，核糖体结合位点RBS和起始密和起始密码码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计的时候要注意。而真核生物的那段保守序影响，在设计的时候要注意。而真核生物的那段保守序列成为列成为Kozak序列（序列（5-GCCACCAUGG-3），要高效），要高效翻译，翻译，+1G和和-3A就很重要。不过如果就很重要。不过如果mRNA没有这段没有这

37、段Kozak序列而有一段适当长度序列而有一段适当长度5UTR也能够有效地在无也能够有效地在无细胞体系中得到翻译。有趣的是，还有数据提示，大肠细胞体系中得到翻译。有趣的是，还有数据提示，大肠杆菌的核糖体通常只认得杆菌的核糖体通常只认得SD序列，而真核比如网织红细序列，而真核比如网织红细胞的核糖体能识别胞的核糖体能识别Kozak序列，也能识别序列，也能识别SD序列。序列。 表达产物中需要加入tag 在表达产物中加入标签序列在表达产物中加入标签序列(tag squence)后后可以方便地利用可以方便地利用ELISA等常规的免疫学方法进等常规的免疫学方法进行活性检测、定量及亲和层析纯化产物；通常行活性

38、检测、定量及亲和层析纯化产物；通常这段标签位点都置于产物的这段标签位点都置于产物的C-末端，这样一般末端，这样一般不会影响抗体片段的活性，在进行直接不会影响抗体片段的活性，在进行直接ELISA时也能保持标签位点的活性。目前常用的标签时也能保持标签位点的活性。目前常用的标签序列有组氨酸串、序列有组氨酸串、FLAG、c-myc10肽及肽及Strep标签。组氨酸串为标签。组氨酸串为5-6个组氨酸，它可以与个组氨酸，它可以与Ni+、Zn2+及及Co+等阳离子结合，因此带有等阳离子结合，因此带有His的抗体的抗体片段可以通过金属螯合层析片段可以通过金属螯合层析 富集、纯化。疏水性多肽序列富集、纯化。疏水

39、性多肽序列DYKDDDDK被称被称为为“FLAG”也可用于检测和纯化重组蛋白，也可用于检测和纯化重组蛋白， 它的特点是既可置于它的特点是既可置于N末端，又可置于末端，又可置于C末端。末端。C-myc10肽是鼠单克隆抗体肽是鼠单克隆抗体9E10的结合表的结合表 位该标签的特点是特异件很高。位该标签的特点是特异件很高。Strep是一段是一段合成的合成的9肽，其序列为肽，其序列为AWRHPQFGG，它能与，它能与 链亲合素链亲合素(streptavidin)结合，用于柱层析纯化，结合，用于柱层析纯化，其不足之处是只能连于其不足之处是只能连于C末端。经改进的末端。经改进的strep tag II (S

40、NWSHPQFEK)的亲和力有所降低，但的亲和力有所降低，但可以连于可以连于N端发挥作用。端发挥作用。二、重组抗体片段的可溶表达 由于可溶表达的抗体可能对宿主菌产生毒性，由于可溶表达的抗体可能对宿主菌产生毒性，因此可溶表达载体应选用严格调控的诱导因此可溶表达载体应选用严格调控的诱导 型启动子来降低本底，过强的启动子因为对大肠型启动子来降低本底，过强的启动子因为对大肠杆菌的分泌、加工能力要求过高而并不能增杆菌的分泌、加工能力要求过高而并不能增 加分泌表达的产量，有时甚至会降低可溶表达的加分泌表达的产量，有时甚至会降低可溶表达的产量，诱导的强度和持续时间也会影响产物的正产量，诱导的强度和持续时间也

41、会影响产物的正确折叠，多数情况下可以利用降低温度来增加可确折叠，多数情况下可以利用降低温度来增加可溶表达的产量，经验值为溶表达的产量，经验值为24-32度。度。(一)可溶表达的实验方案 从新鲜涂布的平板上挑取单菌落，在起从新鲜涂布的平板上挑取单菌落，在起始培养基中培养后转接入始培养基中培养后转接入50ml含抗生素的丰富含抗生素的丰富培养基培养基(2YT或或LB)中培养，如果要进行更大体中培养，如果要进行更大体积的培养，则应将单菌落接种在积的培养，则应将单菌落接种在4ml丰富培养丰富培养基中基中37度培养度培养4-8h，然后再以此培养基转接至，然后再以此培养基转接至大量培养基。如需过夜培养应该在

42、大量培养基。如需过夜培养应该在30度或更低度或更低温度下培养，而不宜在温度下培养，而不宜在37度培养过夜。诱导在度培养过夜。诱导在37度培养至度培养至OD600约为约为0.4-1.0时开始进行。诱时开始进行。诱导条件因启动子不同而异，参见表导条件因启动子不同而异，参见表7-2。加入。加入诱导物后继续振荡培养诱导物后继续振荡培养3h或过夜培养诱导进或过夜培养诱导进行的时间取决于启动子的特性和诱导温度。以行的时间取决于启动子的特性和诱导温度。以下列出不同温度下诱导培养的时间的经验值：下列出不同温度下诱导培养的时间的经验值：15-25度过夜诱导、度过夜诱导、30度诱导度诱导5-6h或更长时间、或更长

43、时间、37度诱导度诱导3-4h。（二）可溶表达条件的优化 1 质粒拷贝数质粒拷贝数 （适中）（适中） 2 mRNA的数量与蛋白质的稳定性的数量与蛋白质的稳定性 3 抗体片断的折叠与组装抗体片断的折叠与组装第三节第三节 抗体在酵母及昆虫细胞中的表达抗体在酵母及昆虫细胞中的表达 一、昆虫表达系统及其在基因工程抗体中一、昆虫表达系统及其在基因工程抗体中的应用的应用 1 以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系 统。统。 2 杆状病毒表达载体（宿主细胞为杆状病毒表达载体（宿主细胞为sf9） 3 杆状病毒表达系统的效率与加工能力杆状病毒表达系统的效率与加工能力 4 稳定转化的昆虫

44、表达系统稳定转化的昆虫表达系统多核多角体病毒MNPV特点： 1 具完整的感染性具完整的感染性 2 不依赖辅助病毒不依赖辅助病毒 3 表达产物多半可溶表达产物多半可溶 4 在自然界生存时间短暂，安全。在自然界生存时间短暂，安全。 5 不能感染脊椎动物。不能感染脊椎动物。Invitrogen公司新式杆状病毒和昆虫细胞表达系统新式杆状病毒和昆虫细胞表达系统特点：特点： 外源基因表达产量高（外源基因表达产量高（1-500mg/L1-500mg/L）；昆虫）；昆虫细胞培养条件简单；昆虫病毒宿主范围窄，细胞培养条件简单；昆虫病毒宿主范围窄，不感染脊锥动物细胞，具较高的安全性。不感染脊锥动物细胞，具较高的安

45、全性。转化方式：转化方式： 同源重组：磷酸钙共沉淀法同源重组：磷酸钙共沉淀法启动子：启动子： 多角体蛋白启动子：非常强，其控制的外多角体蛋白启动子：非常强，其控制的外源蛋白的表达可达到细胞蛋白的源蛋白的表达可达到细胞蛋白的3030。 P10P10蛋白启动子蛋白启动子已有系统：已有系统： ClontechClontech公司的公司的BacPAKBacPAKTMTM杆状病毒表达系统，杆状病毒表达系统，IPLB-Sf21 CellsIPLB-Sf21 Cells，提供两个转移质粒：，提供两个转移质粒：pBacPAK8pBacPAK8和和pBacPAK9pBacPAK9 BaculoDirectBac

46、uloDirect 杆状病毒表达系统是生产杆状病毒表达系统是生产重组杆状病毒最快和最容易的方法重组杆状病毒最快和最容易的方法 不需要烦琐的细菌转化和不需要烦琐的细菌转化和bacmidbacmid的分离，或的分离，或是将转移载体和线性杆状病毒是将转移载体和线性杆状病毒DNADNA共转染进昆虫共转染进昆虫细胞。细胞。经过生物工程改造的经过生物工程改造的BaculoDirectBaculoDirect线性线性DNADNA（杆状病毒基因组），利用快速和有效的（杆状病毒基因组），利用快速和有效的GatewayGateway 重组反应代替了这些烦琐的工作。重组反应代替了这些烦琐的工作。 使用使用Bacul

47、oDirectBaculoDirect系统，从最初的反应混系统，从最初的反应混合物的转染到杆状病毒苗的分离，只需要花费合物的转染到杆状病毒苗的分离，只需要花费大约大约8 8小时小时仅花费了不到传统方法一半的时仅花费了不到传统方法一半的时间！间！ BaculoDirectBaculoDirect系统利用快速、简便的系统利用快速、简便的GatewayGateway技术技术。 BaculoDirectBaculoDirect线性线性DNADNA包含了包含了attRattR位点，允位点，允许与包含有目的基因的许与包含有目的基因的GatewayGateway入门克隆进行入门克隆进行有效的重组。有效的重组

48、。 将将entryentry克隆、克隆、BaculoDirectBaculoDirect线性线性DNADNA和和GatewayGateway LRLR ClonaseClonase酶混合物稍加混匀，在酶混合物稍加混匀，在室温下反应室温下反应1 1小时即可。小时即可。 最终的反应混和物中包含有携带目的基因的最终的反应混和物中包含有携带目的基因的杆状病毒，可以直接用于转染昆虫细胞（杆状病毒，可以直接用于转染昆虫细胞（sf9sf9或或sf21sf21）。）。 酵母表达载体一、外源基因在毕赤酵母中的表达一、外源基因在毕赤酵母中的表达特特 点点： 酵母生长快，易培养，成本低，遗传操作酵母生长快，易培养，

49、成本低，遗传操作方便，对外源蛋白能进行翻译后修饰和加方便，对外源蛋白能进行翻译后修饰和加工。工。 毕赤酵母利用毕赤酵母利用AOX1AOX1强启动子或者强启动子或者3-3-磷酸甘磷酸甘油醛脱氢酶（油醛脱氢酶（GAPDHGAPDH）启动子，可高效表达）启动子，可高效表达外源基因。外源基因。 毕赤酵母的细胞密度可达毕赤酵母的细胞密度可达150g/L150g/L 毕赤酵母可进行糖基化，糖基化位点毕赤酵母可进行糖基化，糖基化位点（Asn-X-Ser/ThrAsn-X-Ser/Thr） 毕赤酵母表达外源蛋白通常步骤：毕赤酵母表达外源蛋白通常步骤： 外源基因表达载体的构建外源基因表达载体的构建 载体载体DN

50、ADNA导入酵母细胞导入酵母细胞 筛选表达载体染色体整合的菌株筛选表达载体染色体整合的菌株 捡出外源蛋白表达情况捡出外源蛋白表达情况 优化发酵条件建立高密度发酵方法优化发酵条件建立高密度发酵方法 建立外源蛋白纯化工艺建立外源蛋白纯化工艺二、酵母表达系统 酵母是一类单细胞真核生物，具备易于操作，遗传酵母是一类单细胞真核生物，具备易于操作，遗传背景清楚，生产成本低等原核生物的特点，又具有真核背景清楚，生产成本低等原核生物的特点，又具有真核生物的折叠、分泌机制，可以完成真核生物特异的蛋白生物的折叠、分泌机制，可以完成真核生物特异的蛋白酶解、折叠、糖基化等翻译后修饰过程。酵母的生长速酶解、折叠、糖基化