生物化学酶促反应动力学课件.pptx

1、研究酶促反应动力学的意义 酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。在研究酶的结构与功响此速率的各种因素的科学。在研究酶的结构与功能的关系以及酶的作用机制时，需要动力学提供实能的关系以及酶的作用机制时，需要动力学提供实验证据；为发挥酶催化反应的高效率，寻找最有利验证据；为发挥酶催化反应的高效率，寻找最有利的反应条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的反应条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制等，都需要掌握酶促反应速率的规律。的作用机制等，都需要掌握酶促反应速率的规律。 二、底物浓度对酶反应速率的影响酶反应速率对底物浓度作

2、图中间复合物学说 为了解释这个现象，为了解释这个现象，Henri和和Wurtz提出了提出了酶底物复合物学说。该学说认为，当酶催化酶底物复合物学说。该学说认为，当酶催化反应时，酶首先与底物结合，生成酶底物复反应时，酶首先与底物结合，生成酶底物复合物，然后生成产物，并释放出酶。反应用下合物，然后生成产物，并释放出酶。反应用下式表示：式表示： S + E ES P + E 酶底物中间复合物存在的证据电子显微镜和电子显微镜和X光衍射直接观察到酶与底物的复光衍射直接观察到酶与底物的复合物。合物。酶与底物结合后光谱发生变化。酶与底物结合后光谱发生变化。溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。溶解度或热稳定性

3、在加入底物后发生变化。分离到了酶底物复合物。分离到了酶底物复合物。超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的现象。现象。平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相同同( (半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧物浓度高于无酶一侧) )。 （1）平衡学说（Henri，Michaelis和和Menten方程）方程） 1902年年Henri和和Brown提出了酶催化的反应提出了酶催化的反应机理机理 1913年年Michaelis和和Menten完善了这个理论

4、，完善了这个理论，他们认为酶反应的第一步是快速可逆的平衡，他们认为酶反应的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。第二步慢，为限速反应。平衡学说推导反应速度方程的假设前提 在推导动力学方程时，有几点假设：在推导动力学方程时，有几点假设： 第一步迅速平衡，第二步慢，即第一步迅速平衡，第二步慢，即 k3 E，S ES。 酶以酶以E和和ES两种状态存在。两种状态存在。 根据平衡学说推导速度方程设设Vf 为为E与与S结合的速度，结合的速度，Vr 为为ES解离的速度，解离的速度，则则Vfk 1 ( E0ES )( SES ) Vrk 2 ES 平衡时平衡时VfVr k 1 ( E0ES )( SE

5、S ) k 2 ES又又 S ES SESS根据平衡学说推导速度方程 k1 ( E0ES ) S k 2 ES 解出解出 ES 得得 ) (012ESSESEkk120SkkSEES 令令 ， 则则 12kkKs0SKSEESS根据平衡学说推导速度方程 由于由于V = k 3 ES，代入前式，代入前式得得 因为当所有的因为当所有的E都成为都成为ES时，可达最大反应时，可达最大反应速度，即速度，即Vm = k 3 E0 ，所以，所以 这就是米氏方程。这就是米氏方程。 03SKSEkVSSKSVVSm0SKSEESS米氏方程SKSVVsm 米氏方程是一个双曲线方程，若以米氏方程是一个双曲线方程，若

6、以SS为自变为自变量，量，V V为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的结果相符。结果相符。 （2）稳态理论 1925年，年，Briggs和和Haldane提出了稳态（提出了稳态（steady state）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正：）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正： 在在 反应式中，反应式中，k3值值不小，后一步骤不是限速步骤。不小，后一步骤不是限速步骤。 所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统中的所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统中的酶底物复合物浓度由零逐渐增加到一定数值，然酶底物复合物浓度由零逐渐增加到一定数值，然后保持不变，即处于稳态

7、水平，后保持不变，即处于稳态水平，此时此时ES的解离和分的解离和分解速率之和等于解速率之和等于ES的形成速率的形成速率，根据稳态学说推导速度方程产生产生ES的速率的速率消耗消耗ES的速率的速率 稳态时稳态时所以所以32ESkESkdtESd0dtESd)(01SESEkdtESd)(3201ESkESkSESEk根据稳态学说推导速度方程 移项得移项得1320)(kkkESSESE)(3201ESkESkSESEk令令 ，代入上式得，代入上式得 132kkkKmmKESSESE)(0将上式中的将上式中的ES解出得解出得 0SKSEESm此此ES即为稳态时的复合物浓度。即为稳态时的复合物浓度。 根

8、据稳态学说推导速度方程因为酶反应速率与因为酶反应速率与ES成正比，即成正比，即 所以所以 3ESkV 03SKSEkVm0SKSEESm又因为当所有的酶都与底物结合形成复合物时，又因为当所有的酶都与底物结合形成复合物时，反应速率达到最大，即反应速率达到最大，即 ，代入上式得，代入上式得 03EkVmSKSVVmmSKSVVsm（稳态法）（稳态法）（快速平衡法）（快速平衡法）两个米氏方程的区别 这两个方程的区别就在于快速平衡法推导这两个方程的区别就在于快速平衡法推导的方程中米氏常数是的方程中米氏常数是Ks，而稳态法推导的米氏，而稳态法推导的米氏方程中米氏常数是方程中米氏常数是Km。 12kkKs

9、 132kkkKmKs是是 ES 的解离平衡常数的解离平衡常数米氏方程的几个特点从米氏方程中可以看出：从米氏方程中可以看出：当当S Km时，时， ，反应速率达到，反应速率达到最大，并与底物浓度无关，属零级反应；最大，并与底物浓度无关，属零级反应；当当S = Km时，时， ，所以，所以，Km的意的意义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。物浓度。mmKSVVmmVSSVV2 2mmVSSVV米氏方程曲线米氏常数的意义 Km是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一定的反应条件下，对于一定的底物，定的反应条件下，

10、对于一定的底物，Km是定值。是定值。 Km可以判断酶的天然底物。有些酶可以作用于几可以判断酶的天然底物。有些酶可以作用于几个底物，其中个底物，其中Km最小的底物是天然底物。最小的底物是天然底物。 当当k3 Km时，时，V = Vm = k3E0，此时对底物来，此时对底物来说是零级反应，对酶来说是一级反应，说是零级反应，对酶来说是一级反应，k3是一级是一级反应速率常数，反应速率常数，k3表示当酶被底物饱和时每秒钟表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（又称为转换数），每个酶分子转换底物的分子数（又称为转换数），这时的这时的k3又可以写成又可以写成 kcat，kcat 越大，说明酶越

11、大，说明酶的的催化效率越高。催化效率越高。 kcat /Km的意义 Kcat /Km表示酶的催化效率，表示酶的催化效率，Kcat /Km越大，越大，催化效率越高。催化效率越高。 ，其最大值极限是，其最大值极限是k k1，而，而k k1是酶与底物结合的速率常数，此常数受是酶与底物结合的速率常数，此常数受到底物在溶液中扩散速度的影响。到底物在溶液中扩散速度的影响。 32313kkkkKkm作图法求Km和Vm值 （Lineweaver-Burk双倒数作图法）双倒数作图法） 将米氏方程两边取倒数得将米氏方程两边取倒数得 在一系列在一系列S下测出相应的反应速率下测出相应的反应速率v，以，以 对对 作图，

12、可得出作图，可得出Km和和Vm值。值。 mmmVSVKV1111SV1米氏方程的双倒数图多底物的酶促反应动力学 （酶促反应按底物分子数的分类酶促反应按底物分子数的分类）底物数酶分类催化反应酶种类占总酶百分数单底物单底物单向单底物单向单底物假单底物假单底物异构酶异构酶裂合酶裂合酶水解酶水解酶A BA B + CA-B + H2O AOH + BH5%12%26%双底物双底物氧化还氧化还原酶原酶转移酶转移酶AH2 B A + BH2A2+ + B3+ A3+ + B2+A + BX AX + B27%24%三底物三底物连接酶连接酶A + B + ATP AB + ADP + Pi A + B +

13、ATP AB + AMP + PPi6%多底物反应按动力学机制分类（序列反应序列反应） 底物的结合和产物的释放有一定的顺序：底物的结合和产物的释放有一定的顺序：E+A+BEABEPQE+P+Q 产物不能在两种底物都结合之前释放。这产物不能在两种底物都结合之前释放。这类反应又可以分为两种类型。类反应又可以分为两种类型。有序反应（ordered reaction） 其中其中P是是B转变的产物，转变的产物，Q是是A转变的产物。转变的产物。如脱氢酶的辅酶如脱氢酶的辅酶NAD(P)+相当于相当于A，NAD(P)H相相当于当于Q。 随机反应（random reaction） 如肌酸激酶催化肌酸与如肌酸激酶

14、催化肌酸与ATP反应生成反应生成磷酸肌酸和磷酸肌酸和ADP。乒乓反应乒乓反应（ping pong reaction） 如转氨酶催化转氨反应：如转氨酶催化转氨反应：氨基酸氨基酸1 酮酸酮酸2 酮酸酮酸1 氨基酸氨基酸2 A B P Q三、酶的抑制作用 因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，而因为某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶的抑而因为某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶的抑制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。能抑制酶活力的物质称为酶的抑制剂（能抑制酶活力的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。

15、）。 研究酶的抑制作用是研究酶的结构和功能、酶研究酶的抑制作用是研究酶的结构和功能、酶的催化机制，以及阐明代谢途径的基本手段，也可的催化机制，以及阐明代谢途径的基本手段，也可以为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依以为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依据。据。抑制程度的表示方法 %100)1 (%100)1 (%0VVaii（1 1）相对活力分数（残余活力分数）相对活力分数（残余活力分数）（2 2）相对活力百分数（残余活力百分数）相对活力百分数（残余活力百分数）（3 3）抑制分数（被抑制而失去活力的分数）抑制分数（被抑制而失去活力的分数）（4 4）抑制百分数）抑制百分数0VVai%1

16、00%0VVai011VVaii抑制作用的类型1不可逆抑制作用（不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。2可逆抑制作用（可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除而使酶恢复活力。去除而使酶恢复活力。可逆抑制作用的3种类型 （1 1）竞争性抑

17、制（）竞争性抑制（competitive inhibition） I 和和 S 竞争与酶的活性中心结合，二者只能竞争与酶的活性中心结合，二者只能结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。竞争性抑制剂举例可逆抑制作用的3种类型（2 2）非竞争性抑制（）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition） I 与与 S 可以分别与酶结合，谁先结合都可以，可以分别与酶结合，谁先结合都可以，形成形成 ESI 三元复合物，但三元复合物，但 ESI 中的中的 S 不能转变成不

18、能转变成产物。这类产物。这类抑制剂是与酶活性中心之外的某个部抑制剂是与酶活性中心之外的某个部位结合。位结合。竞争性和非竞争性抑制剂的抑制机理可逆抑制作用的3种类型（3）反竞争性抑制剂（）反竞争性抑制剂（uncompetitive inhibition） I 只与只与 ES 结合，只有结合，只有 ES 能分解出产物，能分解出产物，ESI 中中的的 S 不能转变成产物。由于不能转变成产物。由于 I 的存在促进了的存在促进了 E 和和S 的的结合，所以称为反竞争性抑制。结合，所以称为反竞争性抑制。 ES + I ESI P + E + I可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别 在反应系统中加入一定

19、量的抑制剂，以及在反应系统中加入一定量的抑制剂，以及不同量的酶，测定反应速率与酶量的关系。斜不同量的酶，测定反应速率与酶量的关系。斜率较小的直线是可逆抑制剂，不通过原点但斜率较小的直线是可逆抑制剂，不通过原点但斜率与对照相同的是不可逆抑制剂。率与对照相同的是不可逆抑制剂。1. control2. irreversible inhibitor3. reversible inhibitor可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别 在反应系统中加入不同量的酶及抑制剂，作不在反应系统中加入不同量的酶及抑制剂，作不同抑制剂浓度下反应速率对酶量的直线。可逆抑制同抑制剂浓度下反应速率对酶量的直线。可逆抑制剂

20、得到的是一组通过原点但斜率不同的直线，不可剂得到的是一组通过原点但斜率不同的直线，不可逆抑制剂得到的是一组不通过原点但斜率与对照相逆抑制剂得到的是一组不通过原点但斜率与对照相同的平行线。同的平行线。一些重要的不可逆抑制剂 （1 1）非专一性不可逆抑制剂）非专一性不可逆抑制剂 有机磷化合物有机磷化合物 有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷化合物 重金属盐重金属盐 烷化试剂烷化试剂 氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和CO 青霉素青霉素（2 2）专一性不可逆抑制剂）专一性不可逆抑制剂 Ks型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 Kcat型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 有机磷化合物 很多农药是有机磷化合物，它们能抑制

21、某些蛋白很多农药是有机磷化合物，它们能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共酶及酯酶的活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合而使酶失活。这类化合物强烈地抑制胆碱酯酶价结合而使酶失活。这类化合物强烈地抑制胆碱酯酶活力，使乙酰胆碱不能水解成乙酸和胆碱，导致乙酰活力，使乙酰胆碱不能水解成乙酸和胆碱，导致乙酰胆碱积累，引起神经中毒症状。所以这类化合物又称胆碱积累，引起神经中毒症状。所以这类化合物又称为神经毒剂。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷为神经毒剂。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒剂夺取下来，定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒剂夺取下来

22、，使酶恢复活力，达到解毒的作用。使酶恢复活力，达到解毒的作用。 有机磷化合物解磷定的解毒机理有机汞化合物 有机汞化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。有机汞化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。过量的半胱氨酸或还原型谷胱甘肽过量的半胱氨酸或还原型谷胱甘肽能解毒。能解毒。 有机砷化合物 有机砷化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。有机砷化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。BAL（二巯基丙醇）能解毒。（二巯基丙醇）能解毒。 路易斯毒气路易斯毒气为了六十一个阶级兄弟重金属盐 Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在高浓度时能使在高浓度时能使酶蛋白变性，低浓度时抑制某些酶的活力。可用金酶蛋白变性，低浓度时抑

23、制某些酶的活力。可用金属螯合剂属螯合剂EDTA、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。 烷化试剂含有一个活泼的卤素离子，能够修饰烷化试剂含有一个活泼的卤素离子，能够修饰酶分子中的许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑酶分子中的许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等。基及硫醚基等。烷化试剂氰化物、硫化物和CO 氰化物能与细胞色素氧化酶中的氰化物能与细胞色素氧化酶中的Fe2+结合，使结合，使酶失活不能呼吸。酶失活不能呼吸。CO与血红蛋白结合阻止氧运输。与血红蛋白结合阻止氧运输。硫化物能与多种含金属的酶形成硫化物能与多种含金属的酶形成较为稳定的络合物，较为稳定的络合物，使

24、酶失活。使酶失活。 糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交联。青霉素与糖肽转肽酶的丝氨酸羟基结合，使细联。青霉素与糖肽转肽酶的丝氨酸羟基结合，使细菌细胞壁不能合成。菌细胞壁不能合成。 青霉素 青霉素的抗菌机理Ks型不可逆抑制剂 此类抑制剂结构与底物类似，并带有高反应性基此类抑制剂结构与底物类似，并带有高反应性基团，与酶活性部位结合后，修饰活性部位的基团使酶团，与酶活性部位结合后，修饰活性部位的基团使酶失活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。失活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。 胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的胰蛋白酶的Ks型抑

25、制剂型抑制剂Kcat型不可逆抑制剂 此类抑制剂不但结构与底物类似，而且需要经酶此类抑制剂不但结构与底物类似，而且需要经酶催化反应后才产生高反应性基团，比催化反应后才产生高反应性基团，比Ks型不可逆抑制型不可逆抑制剂专一性更强。剂专一性更强。 -卤代卤代-D-D-丙氨酸丙氨酸 磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛丙氨酸消旋酶丙氨酸消旋酶可逆抑制剂（底物的类似物底物的类似物）合成叶酸的组分合成叶酸的组分磺胺药物竞争抑制二氢磺胺药物竞争抑制二氢叶酸合成酶的活性叶酸合成酶的活性 蝶呤蝶呤 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸 叶酸叶酸（磺胺药物）（磺胺药物）可逆抑制剂 （过渡态底物类似物过渡态底物类似物） 过渡态底

26、物类似物抑制力更强，因为酶过渡态底物类似物抑制力更强，因为酶对过渡态底物的亲和力比对底物的亲和力强对过渡态底物的亲和力比对底物的亲和力强得多。得多。多种酶催化反应多种酶催化反应时的过渡态底物时的过渡态底物过渡态底物类似物过渡态底物类似物可逆抑制剂 （过渡态底物类似物过渡态底物类似物）可逆抑制剂 （过渡态底物类似物过渡态底物类似物）四、温度对酶反应的影响 在较低温度范围内，酶反应速率随着温度的在较低温度范围内，酶反应速率随着温度的升高而增加，当温度高到一定程度时，酶开始变升高而增加，当温度高到一定程度时，酶开始变性失活，反应速率反而下降。所以对于酶反应来性失活，反应速率反而下降。所以对于酶反应来

27、说，有一个最适反应温度。一般来说，动物细胞说，有一个最适反应温度。一般来说，动物细胞内酶的最适反应温度在内酶的最适反应温度在3540，植物细胞中的，植物细胞中的酶可达酶可达4050，也有一些生长在堆肥、温泉中，也有一些生长在堆肥、温泉中的微生物酶的最适温度更高，如的微生物酶的最适温度更高，如Taq DNA聚合酶聚合酶的最适温度可高达的最适温度可高达70。 需要注意的是，最适温度需要注意的是，最适温度值不是酶的特征性值不是酶的特征性常数，此值随着反应时间的延长而有所下降。常数，此值随着反应时间的延长而有所下降。温度对酶反应速率的影响五、pH对酶反应的影响 酶的活力受环境酶的活力受环境pH的影响，

28、存在一个最适的影响，存在一个最适反应反应pH。酶的最适反应。酶的最适反应pH也不是一个特征性常也不是一个特征性常数，而是受到底物种类和浓度、缓冲液种类和数，而是受到底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变。浓度的不同而改变。4种酶的pH-酶活性曲线胃蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱酯酶胆碱酯酶胰蛋白酶胰蛋白酶pH影响酶活力的原因pH影响酶活力的原因有以下几方面：影响酶活力的原因有以下几方面： 过酸或过碱使酶变性失活。过酸或过碱使酶变性失活。 pH偏离最适偏离最适pH不多时，酶分子中及底物分子不多时，酶分子中及底物分子中各可解离基团的中各可解离基团的解离状态解离状态发生了变化，不利于底

29、发生了变化，不利于底物与酶的结合及催化反应。物与酶的结合及催化反应。 由于酶分子可解离基团的解离状态发生了改变，由于酶分子可解离基团的解离状态发生了改变，导致酶分子导致酶分子构象构象发生改变，不利于底物与酶的结合发生改变，不利于底物与酶的结合及催化反应。及催化反应。最适反应pH示意图六、激活剂对酶反应的影响 有些物质与酶结合后可以提高酶活力，这些物质有些物质与酶结合后可以提高酶活力，这些物质称为酶的激活剂（称为酶的激活剂（activator）或活化剂，它们大部分）或活化剂，它们大部分是无机离子或小分子化合物，少数是大分子物质如蛋是无机离子或小分子化合物，少数是大分子物质如蛋白质。作为激活剂的金

30、属离子有白质。作为激活剂的金属离子有K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+ 等，它们与酶蛋白结合后，或稳定等，它们与酶蛋白结合后，或稳定酶蛋白的构象，或参与底物的结合，或催化反应。酶蛋白的构象，或参与底物的结合，或催化反应。 激活剂对酶反应的影响 不同的激活剂激活不同的酶，有些激活剂激活不同的激活剂激活不同的酶，有些激活剂激活一种酶，却又抑制另一种酶。激活剂的浓度也对其一种酶，却又抑制另一种酶。激活剂的浓度也对其效应有影响，一定浓度时起激活作用，超过这个浓效应有影响，一定浓度时起激活作用，超过这个浓度又起抑制作用。度又起抑制作用。 在机体内有许多调节酶活力的方式，其中抑制在机体内有许多调节酶活力的方式，其中抑制剂和激活剂的调节属于最快速的方式。剂和激活剂的调节属于最快速的方式。