疾病易感性与基因多态性研究进展课件.ppt

1、疾病易感性与基因多态性疾病易感性与基因多态性研究进展研究进展 卫生毒理教研室卫生毒理教研室主要内容主要内容一、一、 疾病易感性与高危人群疾病易感性与高危人群二、二、 基因多态性的概念、生物学作用与意义基因多态性的概念、生物学作用与意义 三、三、 基因多态性的检测方法基因多态性的检测方法 四、关于基因多态性与疾病易感性关系研究的现状四、关于基因多态性与疾病易感性关系研究的现状 五、目前基因多态性研究中存在的问题及对策五、目前基因多态性研究中存在的问题及对策 六、展望六、展望 环境污染对人类健康的威胁日趋严重环境污染对人类健康的威胁日趋严重有关资料统计，由于先天的遗传因素，造有关资料统计，由于先天

2、的遗传因素，造成胎儿畸形占成胎儿畸形占10%-15%，环境因素则，环境因素则占占10%-20%，其它为遗传基因和环境，其它为遗传基因和环境因素的联合作用。目前已发现具有致畸作因素的联合作用。目前已发现具有致畸作用的环境化学污染物有甲基汞、四氯二苯、用的环境化学污染物有甲基汞、四氯二苯、五氯酚钠和有机磷杀虫剂等。五氯酚钠和有机磷杀虫剂等。 Disease环境暴露环境暴露Exposure ？遗传因素遗传因素人类基因组计划（人类基因组计划（1990-）一、易感基因与高危人群一、易感基因与高危人群 人们发现在同一环境因素变化条件下，有的人反应强烈，人们发现在同一环境因素变化条件下，有的人反应强烈，出现

3、患病甚至死亡，有的人反应不大。例如，同是钢铁厂的出现患病甚至死亡，有的人反应不大。例如，同是钢铁厂的冶炼工或电焊工，同在一个车间工作，同样的作业环境，仅冶炼工或电焊工，同在一个车间工作，同样的作业环境，仅有部分人发生锰中毒。这说明不同个体对环境有害因素易感有部分人发生锰中毒。这说明不同个体对环境有害因素易感性存在差异。决定某个体对某种疾病易感性的基因称为易感性存在差异。决定某个体对某种疾病易感性的基因称为易感基因。基因。 对环境因素损害敏感的那部分人群称为高危险人群，在对环境因素损害敏感的那部分人群称为高危险人群，在同一污染环境中，高危险人群比正常人出现健康危害早而且同一污染环境中，高危险人群

4、比正常人出现健康危害早而且程度也严重。在任何居民群体中都有高危险人群，而且所有程度也严重。在任何居民群体中都有高危险人群，而且所有的健康人，在其一生的不同年龄段，不同环境条件下，都有的健康人，在其一生的不同年龄段，不同环境条件下，都有某一时间处于高危险状态的可能。某一时间处于高危险状态的可能。 二、二、 基因多态性的概念、生物学作用与意义基因多态性的概念、生物学作用与意义1 突变突变(mutation) DNA永久的结构改变。在大多数情况下，这样的永久的结构改变。在大多数情况下，这样的DNA变化或者没有影响或者导致伤害，但是有时突变能变化或者没有影响或者导致伤害，但是有时突变能改善生物体生存的

5、机会，将有利的突变传给后代。改善生物体生存的机会，将有利的突变传给后代。 2 在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因的多态性为基因的多态性(gene polymorphism)。这种多态性。这种多态性可 以 分 为 两 类 ， 即可 以 分 为 两 类 ， 即 D N A 位 点 多 态 性位 点 多 态 性 ( s i t e p o l y m o r p h i s m ) 和和 长 度 多 态 性长 度 多 态 性 ( l e n g t h polymorphism)。（一）基因突变与基因多态性（一）基因突变与基因多态性v

6、位点多态性：位点多态性：是由于等位基因之间在特定的位点上是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变（转换和颠换），单个碱基的置换、缺失和包括点突变（转换和颠换），单个碱基的置换、缺失和插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性置换又称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。据估计，单碱基变异的频率在。据估计，单碱基变异的频率在1/1000-2/1000。SNP在基因组中

7、数量巨大，分布频在基因组中数量巨大，分布频密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传标记。标记。 单核苷酸多态性单核苷酸多态性( () )是指个体基因组内是指个体基因组内特定核苷酸位置上的单个碱基发生突变特定核苷酸位置上的单个碱基发生突变, ,这种突变这种突变包括单碱基的转换、颠换、插入或缺失等。严格来包括单碱基的转换、颠换、插入或缺失等。严格来说说, ,只有当等位基因的频率大于或等于只有当等位基因的频率大于或等于1%1%时才能称时才能称得上是得上是, ,然而部分数据库如然而部分数据库如BaseBase把等位基因的频率小于把等位基因的频率小

8、于1%1%的变异也包括在的变异也包括在内内( (见见BaseBase数据库首页说明数据库首页说明) )。 研究表明研究表明, ,人类每对等位染色体上每人类每对等位染色体上每10001000就会出现就会出现1 1个个, ,而整个人类基因组每而整个人类基因组每300300就会出现就会出现1 1个。这样在任意两个个体之个。这样在任意两个个体之间间, ,就有好几百万的单碱基差异和十万个氨基酸的就有好几百万的单碱基差异和十万个氨基酸的不同不同, ,所以在一定程度上反映了人类个体所以在一定程度上反映了人类个体或群体的特异性。或群体的特异性。v长度多态性：一类为长度多态性：一类为可变数目的重复序列可变数目的

9、重复序列（variable number of tandem repeats, VNTRS），它是由于相），它是由于相同的重复顺序重复次数不同所致，它决定了小卫星同的重复顺序重复次数不同所致，它决定了小卫星（minisatellite） DNA长度的多态性。小卫星是由长度的多态性。小卫星是由15-65 bp的基本单位而成，重复次数在人群中是高度变异的基本单位而成，重复次数在人群中是高度变异的。的。 另一类长度多态性是由于另一类长度多态性是由于基因的某一片段的缺失或插入基因的某一片段的缺失或插入所致，如微卫星所致，如微卫星DNA（microsatellite），它们是由重），它们是由重复序列构成

10、，基本序列只有复序列构成，基本序列只有1-8bp,如如(TA)n及及(CGG)n等，通常重复等，通常重复10-60次。次。 长度多态性是按照孟德尔方式遗传的，它们在基因定位、长度多态性是按照孟德尔方式遗传的，它们在基因定位、DNA指纹分析，遗传病的分析和诊断中被广泛地应用。指纹分析，遗传病的分析和诊断中被广泛地应用。99% of one individual DNA sequences will be identical to that of another person. Of the 1% difference, over 90% will be single nucleotide pol

11、ymorphisms (SNPs).（二）基因多态性的生物学作用与意义（二）基因多态性的生物学作用与意义1 生物学作用生物学作用（1） 遗传密码的改变遗传密码的改变 错义突变错义突变(missense mutation) 、无义突变、无义突变(nonsense mutation) 、同义突变、同义突变(same sense mutation) 、移码突变、移码突变 (frame-shifting mutation) （2） 对对mRNA剪接的影响：剪接的影响： 如果点突变发生在内含子的剪切位点，可以产生两种影响：如果点突变发生在内含子的剪切位点，可以产生两种影响：一是原有的剪接位点消失，二是产

12、生新的剪切位点。无论是那一是原有的剪接位点消失，二是产生新的剪切位点。无论是那一种形式，都可以导致一种形式，都可以导致mRNA的错误剪接，产生异常的的错误剪接，产生异常的mRNA，最终产生异常的表达产物，数个碱基的缺失、片段缺失等均有最终产生异常的表达产物，数个碱基的缺失、片段缺失等均有可能造成剪接位点的缺失。可能造成剪接位点的缺失。（3） 蛋白质肽链中的片段缺失：蛋白质肽链中的片段缺失： 无义突变和无义突变和DNA片段的缺失都可以导致肽链中的片段缺失，片段的缺失都可以导致肽链中的片段缺失，致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。移码突变不仅翻译后致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。移码突变不仅翻

13、译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片段缺的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片段缺失。失。（4） 启动子的突变及非转录区的突变：启动子的突变及非转录区的突变：可以使基因的转录水平或活性增强或降低。可以使基因的转录水平或活性增强或降低。 2 基因多态性的生物学意义基因多态性的生物学意义 在预防医学方面，基因多态性的研究涉及的范围广泛，包在预防医学方面，基因多态性的研究涉及的范围广泛，包括基因多态性与病因未知的疾病关系的研究，也包括对已知括基因多态性与病因未知的疾病关系的研究，也包括对已知特定环境因素致病易感基因的筛选。因此开展我国人群的基特定环境因素致病易感基因的筛

14、选。因此开展我国人群的基因多态性与环境的作用关系的研究具有重要的意义。而基因因多态性与环境的作用关系的研究具有重要的意义。而基因多态性的研究在职业病医学中则更具有实际的意义。对易感多态性的研究在职业病医学中则更具有实际的意义。对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，采取针对性预防措施，提高预防职业性危害工人甄别开来，采取针对性预防措施，提高预防职业性危害工作的效率。对特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多态作的效率。对特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多态性研究，有助于阐明环境因素的致病机制，也推动了遗传易性研

15、究，有助于阐明环境因素的致病机制，也推动了遗传易感性标志物的研究。感性标志物的研究。三、基因多态性的检测方法三、基因多态性的检测方法 到目前为止，到目前为止，DNADNA水平遗传多态性标记物的研究已经历了三水平遗传多态性标记物的研究已经历了三个阶段。个阶段。 1 限制性片段长度多态性标记（限制性片段长度多态性标记（RFLPRFLP），这是第一代），这是第一代DNADNA遗传标记，是遗传标记，是D.BotsteinD.Botstein于于19801980年提出的。年提出的。RFLPRFLP的原理：的原理：如果存在如果存在DNA DNA 的多态性，会使的多态性，会使DNA DNA 分子的限分子的限

16、制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。最早是用性片段长度多态性。最早是用Southern Blot/RFLPSouthern Blot/RFLP方法检方法检测，后来采用聚合酶链反应（测，后来采用聚合酶链反应（PCRPCR）与限制酶酶切相结合的）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用方法。现在多采用PCR-RFLPPCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段法进行研究基因的限制性片段长度多态性。长度多态性。 基于、酶切的方

17、法除了以上的基于、酶切的方法除了以上的RFLP还有随机扩增还有随机扩增多态性多态性()-是通过专一识别性内切酶处理产物是通过专一识别性内切酶处理产物,电泳后检测分型电泳后检测分型利用随机引物利用随机引物(约约10)对基因组进行扩增对基因组进行扩增,寻找寻找特征性条带和分型特征性条带和分型;此外此外,还有突变酶学检测还有突变酶学检测()和扩和扩增阻滞突变系统增阻滞突变系统()等。等。 2 DNA DNA重复序列的多态性标记重复序列的多态性标记 重复序列的多重复序列的多态性有小卫星态性有小卫星DNADNA多态性和微卫星的多态性和微卫星的DNADNA多态性等多态性等多种。多种。 3 单 核 苷 酸

18、多 态 性 标 记 （单 核 苷 酸 多 态 性 标 记 （ S N P , s i n g l e S N P , s i n g l e nucleotide polymorphismnucleotide polymorphism），是），是19961996年被美国年被美国的的E.LanderE.Lander提出的，被称为提出的，被称为“第三代第三代DNADNA遗传标遗传标记记”。 其分析的经典方法是采用其分析的经典方法是采用PCR-PCR-单链构象多态单链构象多态性（性（PCR-SSCPPCR-SSCP）分析、）分析、RFLPRFLP、温度梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳（TGGETGGE

19、）、变性梯度凝胶电泳（）、变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）、变性高）、变性高效液相色谱效液相色谱(dHPLC)(dHPLC)和高通量基因芯片技术和高通量基因芯片技术(HA)(HA)等。等。 （1 1）单链构象多态性（）单链构象多态性（SSCPSSCP）：）：是一种基于单链是一种基于单链DNADNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNADNA如如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。在电泳时泳动的速度不同。经扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高经扩增的目的

20、片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并保证在单链状态下温处理使之解链并保证在单链状态下,然后在一定浓度的然后在一定浓度的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳,单链迁移率除与单链迁移率除与浓度有关外浓度有关外,更主要取决于单链所形成的空间更主要取决于单链所形成的空间构象构象,相同长度的单链相同长度的单链,可以因其顺序或单个碱基可以因其顺序或单个碱基差异差异,所形成的空间构象就会不同所形成的空间构象就会不同,其在凝胶中泳动速度其在凝胶中泳动速度不一样不一样,从而显示出带型的差异从而显示出带型的差异,即多态型。即多态型。(2)(2)温度梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳()该方法主

21、要是根据该方法主要是根据带点突变和正常片断由于值的不同将表现出带点突变和正常片断由于值的不同将表现出不同的解链行为不同的解链行为,片断在聚丙稀酰胺凝胶电泳中片断在聚丙稀酰胺凝胶电泳中通过设置温度梯度来进行分离通过设置温度梯度来进行分离,片段到达最低熔解区即片段到达最低熔解区即开始解链开始解链,使片断呈字结构使片断呈字结构,因而降低其迁移速率。一因而降低其迁移速率。一个碱基的不同足以导致迁移速率的不同。该法可用于个碱基的不同足以导致迁移速率的不同。该法可用于200900内的片断内的片断,检出率达检出率达100%,其其值可通过软件预测。值可通过软件预测。 (3)(3)变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电

22、泳()是利用是利用在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳时在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳时,有突变和有突变和无突变会在不同的地方开始解链无突变会在不同的地方开始解链,从而达到分离的目的。从而达到分离的目的。与类似与类似,前者是依靠变性剂使值前者是依靠变性剂使值不同的分子分离不同的分子分离,而后者是依靠温度梯度分离值不而后者是依靠温度梯度分离值不同的分子。检测的片断长度可达同的分子。检测的片断长度可达1000,但但条件较难优化且费时。条件较难优化且费时。 (4)(4)变性高效液相色谱变性高效液相色谱()变性高效液相色谱变性高效液相色谱法法()是一项在和基础上发是一项在和基础上发展起来的检测的突变技术

23、展起来的检测的突变技术,通过带正电荷的流动通过带正电荷的流动相将带负电荷的分子吸附到固定相上相将带负电荷的分子吸附到固定相上,基于同源基于同源双链和异源双链解链温度的不同双链和异源双链解链温度的不同,通过控制通过控制的温度的温度,将系统维持在使异源双链发生变性的温度将系统维持在使异源双链发生变性的温度,而同而同源双链并未变性的情况下进行分离源双链并未变性的情况下进行分离,样品在样品在55左右的左右的特殊吸附剂中特殊吸附剂中,只需只需6即可完成即可完成50700基因基因片段的分离。的有无最终表现为色谱峰的峰形和片段的分离。的有无最终表现为色谱峰的峰形和数目上数目上,因为异源双链的解链温度较低因为

24、异源双链的解链温度较低,会先形成单螺旋会先形成单螺旋从色谱柱中流出从色谱柱中流出,在色谱图中会形成两个保留时在色谱图中会形成两个保留时间较短的色谱峰。间较短的色谱峰。 DHPLC无法象酶切检测对已知无法象酶切检测对已知SNP实现实现100%检检出出,但它在寻找未知的但它在寻找未知的SNP有明显的优势有明显的优势1，首先酶切无首先酶切无法寻找未知的碱基改变法寻找未知的碱基改变,而且并不是所有的碱基改变都而且并不是所有的碱基改变都能找到酶切位点。能找到酶切位点。 变性梯度凝胶电泳和单链构象多态性均耗时长、检变性梯度凝胶电泳和单链构象多态性均耗时长、检出率低出率低,测序的成本高测序的成本高,DHPL

25、C检出一个样品仅需几分钟检出一个样品仅需几分钟,且全自动化且全自动化,因此可以采用因此可以采用DHPLC对大样本进行筛先对大样本进行筛先,再再对特异峰型者进行测序对特异峰型者进行测序,这样可以降低成本、提高工作这样可以降低成本、提高工作效率。效率。 （5 5）基因芯片法：基因芯片法：又称为又称为DNA 微探针阵列（微探针阵列（Micro array）。它集成了大量的密集排列的大量已知的序列）。它集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确片特定位点上的探针杂交

26、，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。这一技术已用于基因多态性的检测。对靶基因的序列。这一技术已用于基因多态性的检测。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围。应用术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围。应用高密度基因芯片检测单核苷酸多态性，为分析高密度基因芯片检测单核苷酸多态性，为分析SNPs提提供了便捷的方法。供了便捷的方法。(6)(6)毛细管电泳毛细管电泳()采用采用20100的细管代替琼

27、脂的细管代替琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳糖和聚丙烯酰胺电泳,片段因离子表面积和分子片段因离子表面积和分子外形的变异导致迁移时间不同而检测。外形的变异导致迁移时间不同而检测。 （7 7）实时荧光定量实时荧光定量PCR：是在是在PCR反应体系中加入荧反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其应用主要包括：病毒感染定量监测、细胞因子表达分析、其应用主要包括：病毒感染定量监测、细胞因子表达分析、基因突变及其多态性。基因突变及其多态性。 在 实 时 定

28、量在 实 时 定 量 P C R 中 要 使 用 荧 光 探 针 ， 其 中 有中 要 使 用 荧 光 探 针 ， 其 中 有TAQman探针和分子灯塔（探针和分子灯塔（molecular beacon MB) )分子灯塔（分子灯塔（molecular beacon MB)又又称为分子信标，称为分子信标，由荧光能量传递技术和线性探针技术改进发展而来。国外由荧光能量传递技术和线性探针技术改进发展而来。国外于于19961996年开始应用研究，是目前最新的核酸检测技术。年开始应用研究，是目前最新的核酸检测技术。其优点有：特异性更高、操作进一步简化，检测更加快捷，其优点有：特异性更高、操作进一步简化，

29、检测更加快捷，而且减少了影响结果的不确定因素。而且减少了影响结果的不确定因素。不足：由于该技术目前还未完全成熟在探针设计、合成、不足：由于该技术目前还未完全成熟在探针设计、合成、标记等方面技术要求高，检测成本较高。标记等方面技术要求高，检测成本较高。四、几类基因的多态性与环境疾病四、几类基因的多态性与环境疾病易感性关系研究的现状易感性关系研究的现状 1 应激蛋白及其基因多态性与疾病易感性的关系应激蛋白及其基因多态性与疾病易感性的关系从原核生物的细菌到真核生物的人类从原核生物的细菌到真核生物的人类,当接触高温或其他应当接触高温或其他应激因素时激因素时,可以合成一组被称为热休克蛋白可以合成一组被称

30、为热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)的蛋白质。其最重要的功能是帮助细胞适应的蛋白质。其最重要的功能是帮助细胞适应一系列应激反应一系列应激反应,而且导致而且导致HSPs表达或表达亚型上的改变表达或表达亚型上的改变,将会对应激因素产生不同的耐受性。因此将会对应激因素产生不同的耐受性。因此,HSPs的多态性的多态性与疾病或机体遭受应激的易感性或耐受性有关与疾病或机体遭受应激的易感性或耐受性有关2。 热休克蛋白属于多基因家族，以人类热休克蛋白属于多基因家族，以人类HSP70HSP70基因家族基因基因家族基因为例：最先被克隆和鉴定的基因是为例：最先被克隆和鉴定的基因是HSP7

31、0-1、HSP70-2和和HSP70-Hom除了以上三个基因，目前对除了以上三个基因，目前对HSP70家族其他家族其他基因研究的不多。基因研究的不多。HSP70家族成员均可以作为分子伴侣家族成员均可以作为分子伴侣,促进新合成蛋白质促进新合成蛋白质的正确折叠、装配和转运的正确折叠、装配和转运,促进变性或损伤蛋白质的再折促进变性或损伤蛋白质的再折叠或降解等叠或降解等,参与机体的免疫功能。参与机体的免疫功能。目前研究得最多的与目前研究得最多的与HSP70多态性有关的疾病是一些与多态性有关的疾病是一些与自身免疫紊乱有关的疾病，如：自身免疫紊乱有关的疾病，如：HSP70-2基因多态性被看基因多态性被看作

32、是系统性红斑狼疮（作是系统性红斑狼疮（SLE）的一个新的易感性标记物。）的一个新的易感性标记物。 MestiriMestiri等的研究表明等的研究表明HSP70-2HSP70-2基因的变异不仅是乳腺癌基因的变异不仅是乳腺癌危险性增加的标记物危险性增加的标记物, ,而且可能预示其临床结果的好坏而且可能预示其临床结果的好坏33 JalboutJalbout等的研究表明等的研究表明HSP70-2HSP70-2的基因型是土耳其鼻咽癌的基因型是土耳其鼻咽癌危险性增高的标记物危险性增高的标记物44。 2 癌基因、抑癌基因多态性与疾病易感性的关系癌基因、抑癌基因多态性与疾病易感性的关系 rasras基因家族

33、与人类肿瘤相关的特征性基因有三种，即基因家族与人类肿瘤相关的特征性基因有三种，即H-H-ras,K-ras,N-rasras,K-ras,N-ras它们分别定位于它们分别定位于1111、1212、1 1号染色体前号染色体前二者是大鼠肉瘤病毒的转化基因，后者是从人神经母细二者是大鼠肉瘤病毒的转化基因，后者是从人神经母细胞瘤中分离得到的。它们编码的蛋白质分子量为胞瘤中分离得到的。它们编码的蛋白质分子量为21KD,21KD,称称为为P21P21蛋白。在人类部分肿瘤中蛋白。在人类部分肿瘤中, ,只要只要3 3个个rasras基因中有一基因中有一个基因发生点突变个基因发生点突变, ,就会引起突变位点上的

34、基因发生改变就会引起突变位点上的基因发生改变, ,这些位点的突变使这些位点的突变使rasras基因激活基因激活, ,导致导致P21P21蛋白的过度生成蛋白的过度生成, ,持续不断地将信号传入细胞持续不断地将信号传入细胞, ,造成细胞的转化或恶变造成细胞的转化或恶变55。 突变突变rasras癌基因的种类与某些肿瘤类型密切相关。如：与癌基因的种类与某些肿瘤类型密切相关。如：与肺癌、结肠癌、胰腺癌的发生发展密切相关的是肺癌、结肠癌、胰腺癌的发生发展密切相关的是K-rasK-ras基基因的激活，造血系统肿瘤多发现因的激活，造血系统肿瘤多发现N-rasN-ras的突变，泌尿系统的突变，泌尿系统肿瘤则以

35、肿瘤则以H-rasH-ras突变为主。因此研究突变为主。因此研究rasras基因突变对于了基因突变对于了解肿瘤的发生、发展具有重大意义。解肿瘤的发生、发展具有重大意义。ahrendtahrendt等等66对对106106例肺腺癌患者进行例肺腺癌患者进行K-rasK-ras基因突变研究基因突变研究, ,发现发生突变的发现发生突变的2929例患者全部是吸烟者例患者全部是吸烟者, ,而未吸烟者肺癌而未吸烟者肺癌中未检测到中未检测到K-rasK-ras基因突变基因突变, ,因此认为肺腺癌患者中因此认为肺腺癌患者中K-rasK-ras基因突变与吸烟有着密切联系。基因突变与吸烟有着密切联系。以以rasra

36、s基因作为分子标记物基因作为分子标记物, ,以肺癌患者的痰液、胸液、以肺癌患者的痰液、胸液、纤支镜取材等材料作为检测对象纤支镜取材等材料作为检测对象, ,应用聚合酶链反应、聚应用聚合酶链反应、聚合酶链反应合酶链反应 限制性酶切片段长度多态性分析及直接测序限制性酶切片段长度多态性分析及直接测序法等检测手段法等检测手段, ,检测组织中检测组织中K-rasK-ras基因突变热点基因突变热点1212、1313、6161等密码子的突变情况等密码子的突变情况, ,同时结合荧光纤支镜、高分辨同时结合荧光纤支镜、高分辨CTCT、超声、正电子发射计算机断层扫描等检查手段超声、正电子发射计算机断层扫描等检查手段,

37、 ,可以发现可以发现肺癌高危人群肺癌高危人群, ,对肺癌的癌前病变及早期肺癌作出诊断对肺癌的癌前病变及早期肺癌作出诊断7,87,8。 3 代谢酶基因多态性与疾病易感性的关系代谢酶基因多态性与疾病易感性的关系 目前研究较多的是细胞色素目前研究较多的是细胞色素P450P450，人类，人类P450基因已知有基因已知有17个家族个家族,其中有其中有20个亚家族已在人类基因组中定位。参个亚家族已在人类基因组中定位。参与人体代谢的主要为与人体代谢的主要为CYP1至至CYP3家族以及家族以及CYP4家族部家族部分成员的基因产物分成员的基因产物9。外源化学物通过呼吸道、消化道、。外源化学物通过呼吸道、消化道、

38、皮肤等途径进入机体皮肤等途径进入机体,在大多数情况下在大多数情况下,先经由细胞色素先经由细胞色素P450酶催化的酶催化的相反应活化后相反应活化后,由前致癌物转化为致癌物由前致癌物转化为致癌物,与生物大分子发生加合与生物大分子发生加合,造成基因损伤造成基因损伤,启动化学致癌过程。启动化学致癌过程。 研究发现研究发现CYP1ACYP1A1 1, CYP1A, CYP1A2 2, CYP1B, CYP1B1 1, CYP2A, CYP2A6 6,CYP2C,CYP2C9 9, , CYP2CCYP2C1919, CYP2D, CYP2D6 6, CYP2E, CYP2E1 1, CYP3A, CYP

39、3A4 4, CYP3A, CYP3A5 5等基因存在多等基因存在多态性。态性。P450P450家族中存在的基因多态性使不同基因型携带家族中存在的基因多态性使不同基因型携带个体对特定的外源化合物代谢能力不同个体对特定的外源化合物代谢能力不同, ,由此造成个体在由此造成个体在环境因素暴露引起的健康损害存在易感性的差异。环境因素暴露引起的健康损害存在易感性的差异。国内有人研究了慢性锰中毒易感性与国内有人研究了慢性锰中毒易感性与CYP2DCYP2D6 6基因第基因第29382938位突变的联系位突变的联系( (该突变使酶活性降低该突变使酶活性降低),),认为野生型较突变认为野生型较突变型有更高的锰中

40、毒易感性型有更高的锰中毒易感性1010。 叶酸代谢通路与叶酸代谢通路与DNA合成和甲基化有关合成和甲基化有关MTHFR GenotypeCasesControlsAdjustedOR (95%CI)No %No %All CasesC677T （Ala Val）CC (ref.) 55 29.460 36.11.00CT90 48.180 48.21.24 (0.77-2.01)TT42 22.526 15.71.87 (1.00-3.48)Gastric Cardia CancerCC (ref.) 22 26.860 36.11.00CT38 46.480 48.21.29 (0.69-2

41、.44)TT22 26.826 15.72.47 (1.14-5.32)Shen H., et al. Int J Cancer 2001;95:332-6. IF=4.06叶酸代谢酶基因叶酸代谢酶基因MTHFR多态性与中国人多态性与中国人胃癌（贲门癌）遗传易感性胃癌（贲门癌）遗传易感性4 修复基因多态性与疾病易感性的关系修复基因多态性与疾病易感性的关系 在外来有害因素作用下会导致机体细胞内在外来有害因素作用下会导致机体细胞内DNADNA出现碱出现碱基错配、插入、缺失等结构改变，而人体内的基因修复基错配、插入、缺失等结构改变，而人体内的基因修复酶可通过不同机制帮助机体修复这些错误，保护人体健酶

42、可通过不同机制帮助机体修复这些错误，保护人体健康，相反如果修复基因出现突变以致修复酶功能缺陷可康，相反如果修复基因出现突变以致修复酶功能缺陷可与某些疾病的发生有关。如：与某些疾病的发生有关。如： MED1MED1是一种碱基切除修复是一种碱基切除修复酶，能够直接或间接地帮助细胞修复癌症对基因的损害。酶，能够直接或间接地帮助细胞修复癌症对基因的损害。 研究中发现：缺陷的研究中发现：缺陷的Med1基因与非息肉型的结肠直基因与非息肉型的结肠直肠肿瘤（最常见的遗传性结肠直肠癌）有关。因此对修肠肿瘤（最常见的遗传性结肠直肠癌）有关。因此对修复基因多态性进行研究有助于深入了解某些疾病的发生、复基因多态性进行

43、研究有助于深入了解某些疾病的发生、发展机制并可采取有效措施如：对高危险人群进行筛选发展机制并可采取有效措施如：对高危险人群进行筛选等对相关疾病进行预防。等对相关疾病进行预防。 20022002年，刘汝清年，刘汝清1111等采用聚合酶链式反应等采用聚合酶链式反应(PCR) (PCR) 单单链构象多态性链构象多态性(SSCP) DNA(SSCP) DNA直接测序法对直接测序法对100100例正常人和例正常人和8888例肿瘤患者外周血白细胞进行例肿瘤患者外周血白细胞进行MGMTMGMT基因多态性研究。基因多态性研究。 结果发现：结果发现：MGMTMGMT基因第基因第3 3、4 4、5 5外显子上存在

44、着多态性外显子上存在着多态性, ,其中第其中第3 3、4 4外显子的多态改变与肿瘤形成的关系较弱外显子的多态改变与肿瘤形成的关系较弱, ,而而第第5 5外显子的多态仅见于肿瘤患者外显子的多态仅见于肿瘤患者, ,可能与肿瘤的形成有可能与肿瘤的形成有关。关。MGMTMGMT基因的多态性主要表现为同义突变和错义突变基因的多态性主要表现为同义突变和错义突变, ,而且多为单个碱基的变异。点突变所致的单一氨基酸替而且多为单个碱基的变异。点突变所致的单一氨基酸替换换, ,如果发生在关键区域如果发生在关键区域, ,可显著改变蛋白质的结构和功可显著改变蛋白质的结构和功能。弄清楚能。弄清楚MGMTMGMT基因变异

45、的特征是理解其多态现象意义基因变异的特征是理解其多态现象意义的关键。的关键。五、目前基因多态性与疾病易感性五、目前基因多态性与疾病易感性关系研究中存在的问题及对策关系研究中存在的问题及对策 1 由于多种原因，目前的研究大多还只是泛泛地进行频由于多种原因，目前的研究大多还只是泛泛地进行频率调查或是简单地了解单个基因多态性与疾病发生、预率调查或是简单地了解单个基因多态性与疾病发生、预后、转归的联系。没有大量进行多个基因之间多态性与后、转归的联系。没有大量进行多个基因之间多态性与疾病易感性的综合分析研究。疾病易感性的综合分析研究。2 研究的样本要足够大，具有充分的代表性。研究的样本要足够大，具有充分

46、的代表性。3 对于多基因病，应根据疾病病理生理学改变，选择多对于多基因病，应根据疾病病理生理学改变，选择多个候选基因客观地从不同的侧面进行分析。个候选基因客观地从不同的侧面进行分析。 4 候选基因的选择要有明确的病理生理学基础：研究某候选基因的选择要有明确的病理生理学基础：研究某种疾病基因多态性与其发病及的联系，所选择候选基因种疾病基因多态性与其发病及的联系，所选择候选基因的基因产物在该病发病机制中所起的作用应该得到肯定。的基因产物在该病发病机制中所起的作用应该得到肯定。5 当病例调查从发生频率及功能研究上均能确定某一候当病例调查从发生频率及功能研究上均能确定某一候选基因多态性与疾病的发生、发

47、展有肯定的联系后，应选基因多态性与疾病的发生、发展有肯定的联系后，应进行进行“复核验证复核验证”。即根据初步研究中所得出的结论在。即根据初步研究中所得出的结论在 “散发散发”病例的观察中进行验证。明确前面所得到的假病例的观察中进行验证。明确前面所得到的假设是否可靠。设是否可靠。 6 研究过程中遇到的实际问题有：研究过程中遇到的实际问题有：nWhich genes & which SNPs should we start with（从哪些基因哪些位点开始）（从哪些基因哪些位点开始）? ?nPolymorphisms of Low-penetrance genes: Why are the res

48、ults always inconsistent? （为何相关性研究结果总是不一致？）（为何相关性研究结果总是不一致？）nHow large the sample size is in molecular epidemiological studies (SNPs)? （样本量多大合适？）（样本量多大合适？）Which gene should we start with? Consideration of biology - Based on the mechanism of the disease(Biological plausibility, a definitive scientifi

49、c hypothesis)nSusceptive genes e.g. BRCA1, MSH2nSensitive genes e.g. GSTM1, GSTT1 XRCC1, XPD CyclinD1, P53 Inconsistence of previous association studies of SNPsnLow-penetrance genesnSmall sample sizenPublication biasnExcessively emphasize the stratified results (without the main effect!) nLimitation

50、s of observational studiesPublication biasnThe selection from editor nThe abandon by researcher himselfnToo many subgroup results nLarge independent study with precise designnMulti-center collaborationHow big should the sample size be?nHow many genes and how many SNPs involvednHow high the frequency